细胞膜表面有许多糖脂、糖蛋白构成的复合物,参与信号转导、分子粘附等分子相互作用,与细胞生长、凋亡、运动、分化等重要生命过程密切相关。Lewisy抗原是双岩藻糖基化的寡糖,是细胞表面具有重要生物学意义的岩藻糖基化抗原,属于A、B、H、Lewis血型家族。Lewisy抗原存在于上皮细胞,在生理情况下,胚胎着床过程中,胚泡表面阶段性特异表达的Lewisy抗原对胚泡与子宫间的识别与粘附起重要作用。病理情况下,当细胞癌变时Lewisy的表达增加,如在卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌和非小细胞肺癌等癌组织中。岩藻糖转移酶种类较多,其中α1,2-岩藻糖转移酶与岩藻糖基化形成Lewis b、Lewisy、H抗原相关。我们在前期工作中利用基因转染技术将人的α1,2-岩藻糖基转移酶(α1,2-fucosyltransferase,α1,2-FT)基因转入卵巢癌细胞系RMG-1,建立Lewisy抗原高表达细胞系RMG-1-H,通过比较两细胞系生物学行为的特征,证明基因转染后细胞系的增殖能力提高,粘附、侵袭、转移及耐药等能力增强,提示Lewisy抗原在卵巢癌的发生、发展、侵袭转移中有重要作用。　　 整合素家族是广泛存在于细胞表面的粘附分子,介导细胞与细胞外基质(ECM)、细胞与细胞的相互作用。整合素αvβ3作为整合素家族一重要成员,在肿瘤生长、侵袭转移及耐药等诸多过程中都起了重要作用。很多研究证实,细胞表面的糖链抗原与整合素家族有着密切的关系,整合素蛋白分子被糖基修饰后才能发挥正常的功能。我们在前期工作中已经证实,基因转染后细胞中Lewisy抗原增加的同时,整合素α5β1也同时增加,同时证明Lewisy抗原是整合素α5β1的结构的一部分。　　 越来越多的证据表明,整合素αvβ3不仅作为ECM的黏附分子发挥作用,而且还能将细胞外的刺激信号转入细胞内,所以,研究整合素的信号传导通路,有助于揭示肿瘤细胞生物学行为的改变的机制。其中激活黏着斑蛋白激酶(focaladhesion kinase,FAK)是许多整合素信号系统的重要部分。FAK被认为是整合素依赖性信号转导通路的基础分子,在整合素介导的信号转导通路中起着至关重要的作用。本试验将在前期研究的基础上,探讨Lewisy抗原与整合素αvβ3二者的相关性,并通过检测整合素转导通路的关键因子FAK,探讨Lewisy抗原介导整合素αvβ3与玻璃粘连蛋白的粘附对卵巢癌生物学行为的影响及机制。　　 材料和方法：　　 一、实验材料:　　 (1)选取大连医科大学附属二院妇产科及大连市妇产医院手术切除组织制成的石蜡标本,其中原发性卵巢上皮性癌95例,交界性卵巢上皮性肿瘤37例,良性卵巢上皮性肿瘤20例,正常卵巢组织20例。年龄27～68岁,平均42.8岁。　　 (2)细胞系:细胞系RMG-1来源于人上皮性卵巢癌组织,RMG-1-H为RMG-1转染α1,2-岩藻糖转移酶(α1,2-fucosyltransferas,α1,2-FT)基因,稳定高表达Lewisy抗原细胞系。　　 二、实验方法　　 (1)采用免疫组织化学法检测Lewisy抗原及整合素αvβ3在卵巢癌组织中的表达,免疫荧光双标记法检测Lewisy抗原与整合素αv、β3在卵巢癌组织中的表达相关性。　　 (2)分别采用免疫细胞学的方法、免疫印迹、免疫共沉淀法、实时定量PCR方法检测卵巢癌RMG-1及RMG-1-H细胞系中的整合素αv、β3的蛋白及基因表达。　　 (3)利用Lewisy抗体进行抗体阻断实验,再采用免疫细胞学方法及westernblot方法检测转染前后两细胞中整合素αv和β3的表达情况。　　 (4)应用玻连蛋白(VN)包被细胞培养皿,在其上培养细胞,构建细胞粘附模型,观察细胞粘附及移行能力的改变。　　 (5)VN上培养细胞,应用免疫印迹法检测细胞中FAK、p397FAK蛋白的表达;再经Lewisy抗体处理细胞后,检测细胞中的FAK、p397FAK蛋白表达的变化。　　 结果：　　 (1)上皮性卵巢恶性肿瘤中Lewisy抗原表达显著高于良性卵巢上皮性肿瘤及正常卵巢组织中的表达(P均＜0.01)。　　 (2)与临床病理参数之间分析发现,Lewisy抗原及整合素αv/β3表达均与盆腹腔扩散转移呈正相关(P均＜0.01)。　　 (3)卵巢癌组织中Lewisy与整合素αvβ3表达水平的相关性分析发现,将各组数据进行spearman相关性分析,得出Lewisy与整合素αv及β3亚基之间均具有正相关性(P均＜0.01),Lewisy与整合素αv相关系数为0.731,与β3的相关系数为0.605,经Kappa,检验发现Lewisy与整合素αv及β3亚基之间表达具有一致性(P=0.000)。　　 (4)应用前期工作中已经建立的转染α1,2-岩藻糖转移酶(α1,2-FT)基因细胞模型卵巢癌细胞系RMG-1-H及未转染细胞RMG-1,观察Lewisy抗原与整合素αv/β3亚基的表达相关性:免疫细胞学试验显示转染后的RMG-1-H细胞中整合素αv/β3亚基的表达明显高于转染前细胞(P＜0.05),转染前后细胞Lewisy抗原与整合素αv/β3亚基的表达有明显相关;实时定量PCR试验结果显示了,高表达Lewisy抗原的RMG-1-H细胞系中整合素αvβ3 mRNA水平较对照组细胞RMG-1升高约3～8倍,从基因水平提示了Lewisy抗原高表达细胞系中整合素αvβ3基因的表达明显增高(P＜0.01)。　　 (5)Lewisy抗原高表达细胞系RMG-1-H中整合素αvβ3亚基蛋白较对照组细胞RMG-1呈现高表达(P＜0.01);免疫共沉淀结果证明:整合素αv及β3蛋白存在的样本中同时检测到Lewisy抗原存在。　　 (6)应用Lewisy抗体处理细胞后检测细胞系整合素αvβ3亚基的表达情况,发现基因转染后前后细胞系整合素αv及β3的表达均相应降低。　　 (7)在包被有细胞外基质蛋白VN的细胞粘附模型上,检测转染前后细胞系的粘附及移行能力,发现转染后RMG-1-H细胞在细胞外基质VN上面的粘附率明显高于转染前细胞(P＜0.01),划痕试验证明,RMG-1-H细胞较RMG-1细胞的移行能力显著增强(P＜0.01)。　　 (8)在细胞外基质蛋白VN上细胞培养,进行western blot方法检测FAK及p397FAK发现,处理前细胞中p397FAK表达水平明显高于Lewisy抗体处理后的细胞(P＜0.01)。　　 结论：　　 (1)细胞表面的Lewisy糖链抗原与整合素αvβ3具有表达及结构相关性;　　 (2)Lewisy高表达细胞系中整合素αvβ3基因表达增高:　　 (3)Lewisy抗原是整合素αvβ3与VN结合介导粘附的关键因子;　　 (4)Lewisy抗原与VN相互作用可以使FAK磷酸化增强。