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目的:外伤性视神经病变(traumatic optic neuropathy,TON)是一种严重的眼科疾病,会造成患者不可逆性视力损伤。迄今为止尚无有效的治疗方法,原因在于缺乏类似于临床机体的动物模型。大型动物在生理结构及病理变化方面与人类相近,以其为基础的仿生态TON模型是视神经损伤修复及再生研究的重要工具。完善大动物TON模型视神经功能及结构的评估标准,是搭建TON大动物模型的基础。视觉电生理作为一种客观的检查方法,能够有效的反映视神经及视网膜的功能变化,被广泛应用于视神经疾病的临床检查及实验研究。但目前尚无成熟稳定的大型动物模型视觉电生理检查方法。本研究以萨能山羊及恒河猴为实验对象,通过改进视觉电生理检查的麻醉方式、刺激参数及检查方法,优化大动物视觉电生理检查的稳定性。再使用优化后的检查方法对视神经损伤的实验动物进行检查,寻找在视觉电生理检查中能够敏感反映大型实验动物视神经及视网膜损伤的具体参数指标。通过对大型实验动物视觉电生理稳定性及敏感性的研究,建立一套适用于大型动物的视觉电生理检查方法,从而为大型实验动物TON模型的研究提供稳定可信的视觉功能评价方法。
方法:本研究使用萨能山羊及恒河猴两种实验动物。通过对萨能山羊视觉电生理检查结果变异系数(coefficient of variation,CV)的统计分析,比较异氟烷麻醉及盐酸赛拉嗪麻醉对闪光视觉诱发电位(FVEP)和图形视网膜电图(PERG)稳定性的影响。通过对不同检查方式CV值的分析比较几种刺激方式或刺激参数对FVEP及PERG检查结果稳定性的影响,在此基础上对检查方法进行优化,建立一套稳定的大动物视觉电生理检查方法。此外,我们利用球后视神经夹伤手术,建立视神经损伤萨能山羊模型,通过在术前、术后1周、4周、8周及12周五个时间点进行OCT检查和瞳孔对光反射检查以及术后12周处死实验动物后进行视网膜神经节细胞免疫荧光染色三种方法确认视神经损伤成功。使用前期研究得出的大动物FVEP及PERG检查方法,通过对球后视神经夹伤手术组及假手术组实验动物术前、术后1周、4周、8周及12周等时间点行视觉电生理检查,进一步评估FVEP及PERG中反映视神经损伤更具敏感性的波形成分。最后,将优化后的大动物视觉电生理检查方法扩展到恒河猴的检查中,评估其稳定情况。
结果:FVEP稳定性研究部分,异氟烷麻醉下FVEP检查在振幅及潜伏期两个方面的CV值均显著低于盐酸赛拉嗪麻醉,具有更好的稳定性。3.0cd·s/m2闪光刺激下FVEP检查结果的CV值显著高于0.025cd·s/m2和0.25cd·s/m2刺激下的CV值,稳定性较差;0.025cd·s/m2与0.25cd·s/m2两种光强下CV值无统计学差异,稳定性相近。在FVEP检查中球型刺激器比手持刺激器CV值更小,稳定性更优。在PERG稳定性研究部分,盐酸赛拉嗪麻醉下检查结果有显著低于异氟烷麻醉的CV值,有更好的稳定性。通过比较盐酸赛拉嗪麻醉下0.1cpd、0.3cpd、3.0cpd及12.6cpd四个刺激频率的CV值可以看出,12.6cpd的稳定性显著低于其他三种刺激频率,而0.1cpd、0.3cpd及3.0cpd三者间的CV值无明显差异。PERG检查时,单眼检查与双眼同时检查的结果无统计学差异。萨能山羊球后视神经夹伤手术组实验动物术后视网膜神经节细胞复合体厚度低于术前;手术眼直接瞳孔对光反射基本消失。视网膜神经节细胞(RGC)免疫荧光染色显示手术组术眼的RGC数目显著低于手术组对侧眼与假手术组双眼。证实球后视神经夹伤确实造成了视神经损伤。对手术组实验动物视觉电生理各成分的术前术后对比显示:与术前水平相比,0.025cd·s/m2闪光刺激下FVEP的P1振幅以及0.25cd·s/m2闪光刺激下FVEP的P2振幅术后出现明显下降,0.025cd·s/m2闪光刺激下FVEP的P2潜伏期较术前明显延长。上述指标在假手术组未见显著改变。PERG检查的P1振幅与术前相比无统计学差异。在恒河猴视觉电生理检查中,FVEP、PERG及PVEP检测指标中各波形潜伏期的稳定性均优于振幅的稳定性,且差异存在统计学意义。
结论:异氟烷麻醉下使用球型刺激器进行0.025cd·s/m2或0.25cd·s/m2闪光刺激可以得到更加稳定的大动物FVEP检查结果;盐酸赛拉嗪麻醉下使用0.1cpd、0.3cpd及3.0cpd三种刺激频率检查可以得到更加稳定的PERG检查结果。在FVEP检查中,0.025cd·s/m2闪光刺激下的P1振幅和P2潜伏期以及0.25cd·s/m2闪光刺激下的P2振幅能够更加敏感的反映大动物视神经损伤。在恒河猴视觉电生理检查中,各指标潜伏期较振幅有更优的稳定性。
方法:本研究使用萨能山羊及恒河猴两种实验动物。通过对萨能山羊视觉电生理检查结果变异系数(coefficient of variation,CV)的统计分析,比较异氟烷麻醉及盐酸赛拉嗪麻醉对闪光视觉诱发电位(FVEP)和图形视网膜电图(PERG)稳定性的影响。通过对不同检查方式CV值的分析比较几种刺激方式或刺激参数对FVEP及PERG检查结果稳定性的影响,在此基础上对检查方法进行优化,建立一套稳定的大动物视觉电生理检查方法。此外,我们利用球后视神经夹伤手术,建立视神经损伤萨能山羊模型,通过在术前、术后1周、4周、8周及12周五个时间点进行OCT检查和瞳孔对光反射检查以及术后12周处死实验动物后进行视网膜神经节细胞免疫荧光染色三种方法确认视神经损伤成功。使用前期研究得出的大动物FVEP及PERG检查方法,通过对球后视神经夹伤手术组及假手术组实验动物术前、术后1周、4周、8周及12周等时间点行视觉电生理检查,进一步评估FVEP及PERG中反映视神经损伤更具敏感性的波形成分。最后,将优化后的大动物视觉电生理检查方法扩展到恒河猴的检查中,评估其稳定情况。
结果:FVEP稳定性研究部分,异氟烷麻醉下FVEP检查在振幅及潜伏期两个方面的CV值均显著低于盐酸赛拉嗪麻醉,具有更好的稳定性。3.0cd·s/m2闪光刺激下FVEP检查结果的CV值显著高于0.025cd·s/m2和0.25cd·s/m2刺激下的CV值,稳定性较差;0.025cd·s/m2与0.25cd·s/m2两种光强下CV值无统计学差异,稳定性相近。在FVEP检查中球型刺激器比手持刺激器CV值更小,稳定性更优。在PERG稳定性研究部分,盐酸赛拉嗪麻醉下检查结果有显著低于异氟烷麻醉的CV值,有更好的稳定性。通过比较盐酸赛拉嗪麻醉下0.1cpd、0.3cpd、3.0cpd及12.6cpd四个刺激频率的CV值可以看出,12.6cpd的稳定性显著低于其他三种刺激频率,而0.1cpd、0.3cpd及3.0cpd三者间的CV值无明显差异。PERG检查时,单眼检查与双眼同时检查的结果无统计学差异。萨能山羊球后视神经夹伤手术组实验动物术后视网膜神经节细胞复合体厚度低于术前;手术眼直接瞳孔对光反射基本消失。视网膜神经节细胞(RGC)免疫荧光染色显示手术组术眼的RGC数目显著低于手术组对侧眼与假手术组双眼。证实球后视神经夹伤确实造成了视神经损伤。对手术组实验动物视觉电生理各成分的术前术后对比显示:与术前水平相比,0.025cd·s/m2闪光刺激下FVEP的P1振幅以及0.25cd·s/m2闪光刺激下FVEP的P2振幅术后出现明显下降,0.025cd·s/m2闪光刺激下FVEP的P2潜伏期较术前明显延长。上述指标在假手术组未见显著改变。PERG检查的P1振幅与术前相比无统计学差异。在恒河猴视觉电生理检查中,FVEP、PERG及PVEP检测指标中各波形潜伏期的稳定性均优于振幅的稳定性,且差异存在统计学意义。
结论:异氟烷麻醉下使用球型刺激器进行0.025cd·s/m2或0.25cd·s/m2闪光刺激可以得到更加稳定的大动物FVEP检查结果;盐酸赛拉嗪麻醉下使用0.1cpd、0.3cpd及3.0cpd三种刺激频率检查可以得到更加稳定的PERG检查结果。在FVEP检查中,0.025cd·s/m2闪光刺激下的P1振幅和P2潜伏期以及0.25cd·s/m2闪光刺激下的P2振幅能够更加敏感的反映大动物视神经损伤。在恒河猴视觉电生理检查中,各指标潜伏期较振幅有更优的稳定性。