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第一部分基于先证者医学外显子组测序技术检测分析DSD患者的致病基因变异目的:性发育障碍（Disorders of sex development,DSD）是一大类以染色体异常、性腺或解剖结构发育不典型为特征的异质性疾病,大多数特定类型DSD发病率在1/100,000以下。其发病机制复杂,临床确诊率低。高通量测序技术凭借其大规模并行快速检测的优势极大地提高了遗传病的分子诊断效率。本研究旨在应用先证者医学外显子组测序技术（proband-only medical exome sequencing,POMES）检测中国DSD患者的基因变异,评估其在DSD诊断中的临床应用价值。方法:1.根据DSD纳入及排除标准,收集患者临床资料并按染色体核型分类;2.采集患者及其家系成员的DNA样本,对先证者行高通量测序,包括文库建立、杂交、富集捕获、上机测序等流程;3.根据测序深度等参数评估数据质量,通过Ingenuity软件对变异进行筛选;4.候选基因变异应用Sanger测序验证后按美国医学遗传学与基因组学学会指南评估致病性,并将数据结果进一步统计分析。结果:1.纳入的88例先证者根据染色体核型分为46,XY DSD（68/88,77.3%）和46,XX DSD（20/88,22.7%）,就诊年龄以914岁最多见;2.测序数据经过滤分析、验证后,47例患者检测到候选变异（53.4%,47/88）,以SRD5A2和AR基因变异最为常见;3.检测到的54个变异中27个为新发现的变异,变异类型包括错义、无义、移码、剪接位点、阅读框内插入/缺失及拷贝数变异,其中致病性变异和可能致病性变异分类分别占44.4%（24/54）和25.9%（14/54）;4.46,XY DSD和46,XX DSD的诊断率分别为45.6%（31/68）和20%（4/20）。结论:1.本部分研究统计了中国人群DSD患者的发病情况,丰富了中国人群罕见DSD的基因谱、突变谱以及表型谱;2.POMES技术结合规范化变异分类可作为46,XY DSD患者的临床一线诊断策略。第二部分1型Leydig细胞发育不全患者的分子遗传学分析目的:睾丸间质细胞发育不全（Leydig cell hypoplasia,LCH）是46,XY DSD的罕见病因之一,由黄体生成素/绒毛膜促性腺激素受体（luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor,LHCGR）基因失活变异所引起。本部分研究旨在分析总结LCH患者的临床资料及分子遗传学特征。方法:1.收集并分析LCH先证者的临床资料,检测血清相关激素指标,行激素激发试验等;2.POMES技术结合Sanger测序分析验证患者基因组变异;3.应用CRYP-SKIP和BDGP预测软件并结合蛋白质的功能结构域,分析评估变异的致病性;4.对先证者手术切除后的异常性腺组织行病理学分析。结果:1.先证者的临床特征主要表现为外生殖器外观与染色体核型不符、腹股沟疝,伴有低水平血清基础睾酮和双氢睾酮且对绒毛膜促性腺激素激发无反应;2.基因检测表明患者LHCGR基因存在两个未被报道过的复合杂合变异,包括受体剪接位点变异c.681-1G>A和移码变异c.15821585del ATAT,p.Ile528*,分别遗传自其父母;3.结合预测软件及所在蛋白结构域的位置分析,两个变异可能分别通过选择性剪接跳跃形成异常剪接产物,以及编码提前终止而形成截短蛋白来影响受体的功能,均可归类为致病性变异;4.先证者切除性腺的组织病理学分析发现睾丸结构发育异常,符合LCH的诊断。结论:本部分研究报道了LHCGR基因上新发现的2个复合杂合变异,进一步拓宽基因型与表型的相关性,分析了受体不同功能结构域致病机理的差异。第三部分HFM1基因变异引起原发性卵巢功能不全致病机制的初步研究目的:原发性卵巢功能不全（Primary ovarian insufficiency,POI）是病因复杂的生殖系统疾病,减数分裂基因HFM1与POI发生相关,然而其致病机制尚不明确。本部分研究拟以在POI患者中鉴定的HFM1错义变异为切入点,分析其可能的致病机理。方法:1.采用定点突变法在HFM1野生型质粒基础上构建突变型表达载体,并将野生型和突变型HFM1质粒瞬时转染入HEK 293T细胞;2.收集转染细胞,提取总RNA,行逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应检测m RNA水平的表达情况,并进行统计学分析;3.提取转染细胞的总蛋白,行蛋白免疫印迹实验检测蛋白水平的表达情况;4.根据蛋白序列结合SWISS-MODEL、Py MOL等软件构建模拟的蛋白三维结构。结果:1.测序验证7个突变型（c.148、c.1241、c.2206、c.2325、c.2651、c.3367及c.3580）表达质粒构建成功;2.HFM1突变型与野生型质粒在m RNA水平的表达量无统计学差异;3.HFM1突变型质粒在HFM1蛋白表达水平上与野生型质粒无明显差异;4.基于蛋白结构模型,变异p.His414Pro、p.Phe775Leu和p.Ile884Ser位于HFM1蛋白的关键功能结构域,而p.Gly736Ser和p.Ser1123Pro则位于重要基序中。结论:1.本部分研究发现在人类POI疾病中已报道的HFM1基因错义变异未影响体外HFM1蛋白的表达,这些变异并非通过降低蛋白表达而致病;2.根据变异所在蛋白质结构的位置、氨基酸理化性质的改变等,推测其致病机制可能是影响相关重要结构域和基序而引起酶功能异常,为下一步深入研究提供了线索。