论文部分内容阅读
药物洗脱支架(Drug-Eluting Stent,DES)引起的血管内皮修复延迟,是导致支架血栓、支架再狭窄等主要不良心血管事件(Major adverse cardiovascular events,MACE)的一个重要病理环节。因此,单纯抑制血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMC)增殖,不仅未能根本解决介入后血管再狭窄的问题,而且有增加支架血栓的风险。如何抑制VSMC增殖,又能促进血管内皮修复,是目前介入研究领域的一个难点。支架置入过程,常伴随内皮层瓦解,活性氧(Reactive oxygen species,ROS)瀑布式产生,且永久性金属支架结构也不断刺激血管组织,诱发长期氧化应激反应。因此,本论文首先评价抗氧化剂对冠心病介入患者MACE的有效性。经Meta分析证明,在介入后常规治疗基础上,给予抗氧化剂(普罗布考)干预,可降低冠心病介入患者MACE发生率,这与抗氧化剂降低再次血运重建,改善血脂水平相关。也为本论文选取实验模型提供了参考依据。现代药理研究发现,莪术主要成分具有抗氧化应激、抗炎症反应、减缓动脉粥样硬化发生发展的作用。莪术愈创木烷型倍半萜化合物(ZGS)是中药莪术中的重要活性成分。课题组前期研究发现,在小型猪血管损伤模型中,ZGS支架可促进支架梁包埋,减轻内膜增生。但是,具体的作用机制尚未清楚。因此,本论文围绕ZGS对损伤血管的修复作用,进行如下研究:(1)莪术愈创木烷型倍半萜化合物对氧化应诱导内皮细胞损伤的研究;(2)莪术愈创木烷型倍半萜化合物对血管平滑肌细胞表型转化、增殖迁移的研究;(3)莪术愈创木烷型倍半萜化合物对球囊损伤血管的修复作用。研究一抗氧化剂对冠心病介入后患者主要不良心血管事件的Meta分析目的:评价抗氧剂对改善冠心病介入后患者主要不良心血管事件(MACE)的有效性。方法:检索 PubMed,EMBASE,ScienceDirect and the cochrane central register of clinical trial,中文学术期刊全文数据库(CNKI)和万方数据库(WFDP)等电子数据库进行检索。中英文检索词包括“抗氧化剂”或“普罗布考”或“维他命C”或“维他命E”或“N-乙酰半胱氨酸”和“血管成形术”或“支架”和“随机”。采用Cochrane协作网提供的RevMan5.3软件进行Meta分析。结果:在纳入的349篇文献中,有7篇文献对冠心病介入后患者发生MACE事件进行了报告,其中抗氧化剂(普罗布考,n=352)组,发生MACE事件72例,发生率为20.5%;对照组(n=354)发生MACE事件111例,发生率为31.4%。与对照组比较,普罗布考组明显降低MAEC发生率(RR:0.65,95%CI,0.51 to 0.84,comparisonP = 0.0008)。经亚组分析,与对照组比较,普罗布考组有52例患者发生再次血运重建,发生率为14.8%,显著低于对照组(86例,发生率为24.3%,95%CI,0.44to 0.83,P = 0.002)。两组再次心肌梗死和全因死亡率无显著差异(P= 0.34,P= 0.49)。此外,与对照组比较,普罗布考组显著降低介入后患者总胆固醇和低密度脂蛋白水平(SMD,-0.68,95%CI,-0.87 to-0.49;P<0.00001;SMD,-0.28,95%CI,-0.46 to-0.11;P = 0.001)。结论:与冠心病介入后常规治疗比较,抗氧化剂普罗布考联合常规治疗可明显降低MACE发生率,该作用与普罗布考降低再次血运重建,改善总胆固醇和低密度脂蛋白水平相关。研究二莪术愈创木烷型倍半萜化合物对氧化应激诱导内皮细胞损伤的研究目的:观察ZGS对氧化应激(过氧化氢,H2O2)诱导内皮细胞损伤的作用。方法:给予不同浓度的H2O2刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs),干预不同的时间(0、12、24h),利用MTT法和划痕实验观察HUVECs活性和迁移,建立氧化应激损伤模型。模型建立后,给予ZGS(5、10、20和40ug/ml)干预24 h,观察ZGS对H2O2诱导HUVECs损伤的作用。利用transwell实验和划痕实验观察HUVECs迁移力;采用Western blot、RT-PCR、小干扰RNA技术和细胞免疫荧光技术观察ZGS调节内皮细胞修复的相关机制(Cav-l、eNOS、SDF-lα、MAPKs 和 Nrf2)。结果:(1)与空白组比较,H2O2浓度为500ug/ml,干预24 h,显著降低HUVECs迁移和活性(均P<0.01)。给予ZGS(5、10、20和40ug/mL)作用24 h,ZGS剂量依赖性地逆转H2O2损伤的HUVECs迁移。(2)与空白组比较,H2O2上调Cav-1蛋白表达,下调eNOS蛋白和磷酸化(Ser1177)表达。给予ZGS处理24 h,ZGS浓度依赖性地下调H2O2诱导的Cav-1表达,增加eNOS磷酸化(Ser1177)水平(P>0.05)。给予 eNOS 抑制剂 L-NAME,与 ZGS+H2O2组比较,ZGS+H2O2+L-NAME 下调 eNOS 磷酸化(Ser1177)水平(P<0.01)和细胞迁移力(P<0.01)。分别沉默eNOS和Cav-1蛋白表达,ZGS未能调节H2O2诱导的eNOS磷酸化(P>0.05)和Cav-1水平(P>0.05)。(3)与H2O2组比较,ZGS作用24h浓度依赖性地上调H2O2诱导的SDF-1α和P-38表达,但尚未改善P-JNK和P-Erk1/2表达。沉默Cav-1后,ZGS未改善H2O2诱导的SDF-1α和P-P38表达(均P>0.05)。(4)与H2O2组比较,ZGS干预24 h,可促进H2O2诱导的Nrf2核转移。结论:ZGS改善氧化应激诱导的内皮细胞损伤,促进内皮细胞迁移和抗氧化应激能力,其机制与调节Cav-1/P38/eNOS信号通路和Nrf2核转移相关。研究三莪术愈创木烷型倍半萜化合物对血管平滑肌细胞表型转化、增殖迁移的研究目的:观察ZGS对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的人冠脉平滑肌细胞(HCSMCs)表型转化、增殖迁移的作用。方法:利用TNF-α诱导HCSMCs从收缩型向合成型转化。给予ZGS(5、10、20和40ug/mL)干预24h,观察ZGS对TNF-α诱导的HCSMCs表型转化、增殖迁移的作用。利用划痕实验和trαnswell小室实验评价HCSMCs迁移力;采用流式细胞术观察细胞周期;采用Western blot和小干扰RNA沉默技术观察ZGS调节HCSMCs表型转化、增殖迁移的相关机制。结果:(1)TNF-α(50 ng/ml)刺激 HCSMCs 24 h,HCSMCs 增殖水平显著增加(P<0.01),且细胞形态变为“扁平状”,建立HCSMCs表型转化模型。(2)与TNF-α组比较,给予ZGS干预24 h,HCSMCs维持在“谷峰状”,ZGS+TNF-α 浓度依赖性地(5、10、20 和 40 ug/ml)抑制HCSMCs增殖于G0/G1期,同时,抑制HCSMCs迁移。(3)与TNF-α组比较,TNF-α+ZGS浓度依赖性地上调SMH-HMC和calponin表达,下调S100A4蛋白表达,SM-α-actin未见改变。(4)与TNF-α组比较,ZGS干预24 h,浓度依赖性地下调TNF-α诱导的Cx43蛋白水平,上调Cx40和Cx37蛋白水平。(5)与TNF-α比较,ZGS浓度依赖性地上调TNF-α诱导的P-Cav-1表达,下调P-Stat3和CyclinD1水平。结论:ZGS可上调TNF-α诱导的收缩蛋白表达,下调合成蛋白表达,抑制HCSMCs从收缩型向合成型转化,并可阻滞HCSMCs增殖迁移,其机制与调节连接蛋白(Cx43、Cx40、和 Cx37)和 Cav-1/Stat3/CyclinD1 信号通路相关。研究四莪术愈创木烷型倍半萜化合物对大鼠球囊损伤血管的修复作用目的:采用球囊损伤大鼠腹主动脉血管模型,观察ZGS对损伤血管的修复作用。方法:建立球囊损伤SD大鼠腹主动脉模型,实验分为5组:假手术组(Sham组、10 只)、模型组(Model 组,10 只)、ZGS20 组(20mg/kg/d,10 只)、ZGS40 组(40mg/kg/d,10 只)和 Cav-1 抑制剂组(MβCD,10 只)。HE 染色观察各组球囊损伤血管壁内膜增生情况;免疫组化观察各组平滑肌表型相关标记蛋白表达;免疫荧光观察各组Cav-1/Cxs(Cx43、Cx40和Cx37)表达。结果:(1)利用HE染色观察各组血管形态,与Sham组比较,模型组管腔内膜增厚(P<0.01),提示模型建立成功。与模型组比较,ZGS20组与ZGS40组内膜增生减少(P<0.05和P<0.01);给予Cav-1抑制剂MβCD,逆转ZGS对内膜增生的抑制作用(均P<0.05)。(2)与模型组比较,ZGS20组与ZGS40组中膜层SMH-HMC表达增加(均P<0.01),内膜层S100A4表达减少(均P<0.01);与ZGS20组或ZGS40组比较,ZGS+MβCD组SMH-HMC表达显著减少(均P<0.01),内膜层S100A4表达显著增加(均P<0.01)。(3)与模型组比较,ZGS20组与ZGS40组内膜层P-Stat3表达减少(均P<0.01);与ZGS20或ZGS40组比较,ZGS+MβCD组内膜层P-Stat3表达显著增加(均P<0.01)。(4)与Sham组比较,模型组中膜层P-Cav-1表达降低,Cx43表达增加,Cx40、Cx37表达减少;给予ZGS逆转球囊损伤诱导的P-Cav-1/Cxs表达。(5)与模型组比较,ZGS20和ZGS40组内皮细胞标记物CD34表达增加(均P<0.01)。结论:ZGS可维持球囊损伤血管的平滑肌细胞呈收缩表型,促进内皮修复,减少内膜增生,其机制与调节Cxs(Cx40、Cx37和Cx43)和Cav-1/Stat3信号通路有关。