乳酸片球菌细菌素的发酵与纯化研究

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乳酸菌细菌素是公认的极具开发潜力的生物防腐剂,品种众多、性质各异,然而迄今为止只有乳酸链球菌素(Nisin)被全世界60多个国家批准使用。因此,努力开发新的乳酸菌细菌素,深入研究已发现的细菌素是当前广大科研工作者的重要任务。本实验室在前期的工作中,已从我国传统发酵酸白菜中分离出一株产细菌素的乳酸片球菌(Pediococcus acidilatici),而针对乳酸片球菌细菌素的研究,国内鲜有报道。本论文将重点研究乳酸片球菌(P. acidilaticiPA003)的细菌素发酵与纯化过程,旨在为其工业化生产提供一些理论参考。具体分为以下四部分内容:一、建立实验室规模分离纯化高纯度细菌素的方法,纯化并鉴定本研究所用的细菌素。建立了硫酸铵分段盐析、SephadexG50凝胶过滤、Macro-Prep High S阳离子交换和反相C18半制备色谱纯化细菌素的方法。应用该方法纯化乳酸片球菌细菌素,可使细菌素最终比活力达到2.59×104AU·mg-1,回收率为3.8%,纯度大于99%,较发酵清液纯化了461.3倍。MALDI-TOF-MS表明该细菌素分子量约为4624Da,与已报道的片球菌素Pediocin PA-1/AcH分子量完全相同。同时也发现P. acidilatici PA003可产生不止一种细菌素。二、建立了膜分离提取细菌素的方法。本研究在优选超滤膜材的基础上,优化了超滤和纳滤工艺,建立了以超滤和纳滤过程为核心的膜分离提取细菌素的方法。结果表明,PS-10膜材为最适超滤膜材,超滤到体积浓缩比为2.5时开始洗滤,洗滤体积为400mL。纳滤过程中,体积浓缩比为4.5时,1000mL的超滤渗透液可浓缩至220mL。经历了超滤、洗滤和纳滤过程,上样液的浓缩倍数为4.5倍,细菌素收率为81.2%。三、建立了基于温度和pH值的P. acidilactici PA003分批发酵动力学模型。在5L发酵罐上研究了基于MRS培养基的P. acidilactici PA003的分批发酵过程,建立了基于温度和pH值的相关动力学模型,从动力学的角度系统研究了温度和pH值对菌体生长、细菌素生成、葡萄糖消耗和乳酸生成的影响。结果表明,菌体最佳生长温度和最佳细菌素产生温度均为35℃左右,最大的细菌素活性Bmax出现在pH值为6.1时。四、优化P. acidilactici PA003的补料分批发酵过程。研究了碳源和氮源对乳酸片球菌P. acidilactici PA003分批发酵过程中菌体生长、细菌素生成、葡萄糖消耗和乳酸生成的影响。并以此为基础研究了P. acidilactici PA003的恒速补料分批发酵和指数补料分批发酵过程。结果表明,分批发酵时,碳源和氮源浓度对细菌素活性和菌体生长代谢影响很大,最优条件为碳源和氮源浓度均为30g·L-1时;第四章建立的分批发酵动力学模型,在葡萄糖浓度1050g·L-1时对菌体、细菌素、乳酸的生成和葡萄糖消耗的模拟依旧适用,但在复杂氮源浓度变化时拟合度不好。指数流加补料可以产生最大的细菌素活性,达2985AU·mL-1,较分批发酵时提高了30%以上。
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