论文部分内容阅读
目的：
重症急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis,SAP)是消化道炎症性疾病，病情进展严重时会引起全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)并导致多器官功能障碍(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)，其中包括肺损伤、肠道损伤以及肾损伤(Pancreatitis-induced kidney injury,PKI)，以致更高的发病率和死亡率。巨噬细胞可被诱导为促炎M1型及修复M2型，参与重症急性胰腺炎及肾损伤的发生发展。Gli2是Hedgehog(Hh)通路下游分子，在炎症反应中起到非常重要的作用，可能通过影响巨噬细胞从M1型向M2型极化，减轻炎症造成的损伤。本文探讨PKI中Gli2参与巨噬细胞极化的具体作用及其可能机制。
方法：
(1)温州医科大学附属第一医院检验科获得胰腺炎患者血清标本，记录尿素氮、肌酐、肾小球滤过率等水平；检测相关炎症指标的表达量，研究重症急性胰腺炎肾损伤时炎症情况。
(2)60只C57BL/6小黑鼠被随机分成2组：控制对照组(生理盐水或假手术组)及模型组(PKI组)。雨蛙素(Cerulein)模型组注射7针100?g/kg的雨蛙素溶液，每次注射相距1小时。最后一针注射完毕后再注射一针10mg/kg的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)溶液。对照组注射相同量的无菌生理盐水。L-精氨酸(L-arginine)模型组注射2针12%4.5g/kg的L-精氨酸，每针间隔1小时，最后一针加注100l/g生理盐水。对照组注射3次与上述相同量的无菌生理盐水。牛磺胆酸钠(sodium taurocholate)模型组开腹后找到胆胰管，用5%1ml/kg的牛磺胆酸钠通过胰胆管逆行注射，模拟临床发病机理，诱导重症急性胰腺炎肾损伤。对照组开腹后逐层缝合。以上三种模型在造成24h后，对小鼠采取安乐死，取血及胰腺、肾等组织。组织于液氮中保存或4%多聚甲醛中固定。一部分组织固定完全后进行脱水包埋，制成病理切片。另一部分组织从液氮中取出，通过液氮研磨提取组织蛋白或RNA。结合组织苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色及血清淀粉酶等指标，观察模型是否成功。通过免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)、蛋白印迹(Western blot,WB)、实时定量荧光聚合酶链反应(Quantitative Real-time Polymerase chain reaction,qRT-PCR)实验进一步验证炎症及Gli2表达情况，用WB探究糖代谢水平。
(3)本研究中的细胞采用经典的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞：RAW264.7。该细胞分别由白介素4(Interleukin,IL-4)(10ng/mL)和LPS(20ng/mL)诱导为M1型和M2型，24h后，收集细胞做WB、流式细胞技术(flow cytometry,FCM)、细胞免疫荧光(immunocytofluorescent,ICF)检测巨噬细胞分型及Gli2的表达。CoCl2(0.15mM)用于模拟巨噬细胞的缺氧环境，GANT61(20?M)用于抑制Gli，检测Gli是否影响巨噬细胞分型变化。过表达Gli2检测巨噬细胞及糖代谢变化。
结果：
(1)临床标本显示，重症急性胰腺炎肾损伤病人炎症情况重(P＜0.05)。
(2)本实验采用雨蛙素、L-精氨酸、牛磺胆酸钠方法均能成功建立稳定的小鼠重症急性胰腺炎肾损伤模型。免疫组化染色显示，巨噬细胞M1型在PKI中为主要的浸润细胞，WB及PCR结果显示PKI中炎症因子表达增加(P＜0.05)，Gli2表达下降(P＜0.05)。糖酵解途径相关蛋白缺氧诱导因子1?(hypoxia inducible factor-1,HIF-1???、葡萄糖转运蛋白(Glucose transporter type1,GLUT1)，丙酮酸激酶2(pyruvate kinase M2,PKM2)等表达增加(P＜0.05)，抑制柠檬酸循环的磷酸化丙酮酸脱氢酶激酶(phospho-pyruvate dehydrogenase kinase1,p-PDHK1)表达增强(P＜0.05)。
(3)巨噬细胞RAW264.7中，Gli2在M2型巨噬细胞中表达增加。抑制Gli2，M2型分化减少。过表达Gli2可促进巨噬细胞由M1型转向M2型(P＜0.05)。能量代谢结果显示，M1型巨噬细胞主要进行无氧糖酵解，M2型巨噬细胞主要进行有氧氧化。细胞免疫荧光显示缺氧时Gli2表达被抑制，此时细胞进行无氧糖酵解。过表达Gli2时，p-PDHK1表达被抑制，无氧糖酵解途径被抑制。
结论：
重症急性胰腺炎肾损伤中巨噬细胞以M1型浸润为主，此时Gli2表达被抑制，无氧糖酵解增强，有氧氧化被抑制。Gli2可诱导巨噬细胞从M1型向M2型分化，参与调节糖代谢重编程。因此推测Gli2可能通过增强有氧氧化途径改变巨噬细胞分型进而改善重症急性胰腺炎肾损伤。Gli2作为巨噬细胞M2型靶标，为临床改善重症急性胰腺炎肾损伤提供新的临床治疗方法和手段。
重症急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis,SAP)是消化道炎症性疾病，病情进展严重时会引起全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)并导致多器官功能障碍(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)，其中包括肺损伤、肠道损伤以及肾损伤(Pancreatitis-induced kidney injury,PKI)，以致更高的发病率和死亡率。巨噬细胞可被诱导为促炎M1型及修复M2型，参与重症急性胰腺炎及肾损伤的发生发展。Gli2是Hedgehog(Hh)通路下游分子，在炎症反应中起到非常重要的作用，可能通过影响巨噬细胞从M1型向M2型极化，减轻炎症造成的损伤。本文探讨PKI中Gli2参与巨噬细胞极化的具体作用及其可能机制。
方法：
(1)温州医科大学附属第一医院检验科获得胰腺炎患者血清标本，记录尿素氮、肌酐、肾小球滤过率等水平；检测相关炎症指标的表达量，研究重症急性胰腺炎肾损伤时炎症情况。
(2)60只C57BL/6小黑鼠被随机分成2组：控制对照组(生理盐水或假手术组)及模型组(PKI组)。雨蛙素(Cerulein)模型组注射7针100?g/kg的雨蛙素溶液，每次注射相距1小时。最后一针注射完毕后再注射一针10mg/kg的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)溶液。对照组注射相同量的无菌生理盐水。L-精氨酸(L-arginine)模型组注射2针12%4.5g/kg的L-精氨酸，每针间隔1小时，最后一针加注100l/g生理盐水。对照组注射3次与上述相同量的无菌生理盐水。牛磺胆酸钠(sodium taurocholate)模型组开腹后找到胆胰管，用5%1ml/kg的牛磺胆酸钠通过胰胆管逆行注射，模拟临床发病机理，诱导重症急性胰腺炎肾损伤。对照组开腹后逐层缝合。以上三种模型在造成24h后，对小鼠采取安乐死，取血及胰腺、肾等组织。组织于液氮中保存或4%多聚甲醛中固定。一部分组织固定完全后进行脱水包埋，制成病理切片。另一部分组织从液氮中取出，通过液氮研磨提取组织蛋白或RNA。结合组织苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色及血清淀粉酶等指标，观察模型是否成功。通过免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)、蛋白印迹(Western blot,WB)、实时定量荧光聚合酶链反应(Quantitative Real-time Polymerase chain reaction,qRT-PCR)实验进一步验证炎症及Gli2表达情况，用WB探究糖代谢水平。
(3)本研究中的细胞采用经典的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞：RAW264.7。该细胞分别由白介素4(Interleukin,IL-4)(10ng/mL)和LPS(20ng/mL)诱导为M1型和M2型，24h后，收集细胞做WB、流式细胞技术(flow cytometry,FCM)、细胞免疫荧光(immunocytofluorescent,ICF)检测巨噬细胞分型及Gli2的表达。CoCl2(0.15mM)用于模拟巨噬细胞的缺氧环境，GANT61(20?M)用于抑制Gli，检测Gli是否影响巨噬细胞分型变化。过表达Gli2检测巨噬细胞及糖代谢变化。
结果：
(1)临床标本显示，重症急性胰腺炎肾损伤病人炎症情况重(P＜0.05)。
(2)本实验采用雨蛙素、L-精氨酸、牛磺胆酸钠方法均能成功建立稳定的小鼠重症急性胰腺炎肾损伤模型。免疫组化染色显示，巨噬细胞M1型在PKI中为主要的浸润细胞，WB及PCR结果显示PKI中炎症因子表达增加(P＜0.05)，Gli2表达下降(P＜0.05)。糖酵解途径相关蛋白缺氧诱导因子1?(hypoxia inducible factor-1,HIF-1???、葡萄糖转运蛋白(Glucose transporter type1,GLUT1)，丙酮酸激酶2(pyruvate kinase M2,PKM2)等表达增加(P＜0.05)，抑制柠檬酸循环的磷酸化丙酮酸脱氢酶激酶(phospho-pyruvate dehydrogenase kinase1,p-PDHK1)表达增强(P＜0.05)。
(3)巨噬细胞RAW264.7中，Gli2在M2型巨噬细胞中表达增加。抑制Gli2，M2型分化减少。过表达Gli2可促进巨噬细胞由M1型转向M2型(P＜0.05)。能量代谢结果显示，M1型巨噬细胞主要进行无氧糖酵解，M2型巨噬细胞主要进行有氧氧化。细胞免疫荧光显示缺氧时Gli2表达被抑制，此时细胞进行无氧糖酵解。过表达Gli2时，p-PDHK1表达被抑制，无氧糖酵解途径被抑制。
结论：
重症急性胰腺炎肾损伤中巨噬细胞以M1型浸润为主，此时Gli2表达被抑制，无氧糖酵解增强，有氧氧化被抑制。Gli2可诱导巨噬细胞从M1型向M2型分化，参与调节糖代谢重编程。因此推测Gli2可能通过增强有氧氧化途径改变巨噬细胞分型进而改善重症急性胰腺炎肾损伤。Gli2作为巨噬细胞M2型靶标，为临床改善重症急性胰腺炎肾损伤提供新的临床治疗方法和手段。