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前言：
由于生活水平的提高、饮食结构的改变、日趋紧张的生活节奏及多坐少动的生活方式等诸多因素的影响,糖尿病发病率增长迅速,呈现世界范围的流行态势。糖尿病已经成为继肿瘤、心血管病变后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。据调查,至2008年5月止,中国成人糖尿病患病率高达9.7%,约九千二百四十几万人罹患糖尿病,而糖尿病前期(包括空腹血糖调节受损和糖耐量异常)的患病人数则更加庞大、。2型糖尿患者占糖尿病总患者数的绝大部分。胰岛素抵抗(insulinresistance,IR)和胰岛β细胞分泌功能缺陷是2型糖尿病发病的核心机制。如果能够对IR进行预防、控制、甚至有效逆转,就可以达到对2型糖尿病的一级预防或二级治疗的目的,降低社会负担,提高患者的生存质量。
关于IR的发生机制有众多不同的观点,包括慢性低度炎症学说、脂肪因子学说、氧化应激学说和内质网应激学说等。这些学说并不是孤立的,不同的病理生理机制之间互相影响、互相促进,最终共同导致IR甚至糖尿病的发生。
内质网是真核细胞中重要的细胞器,对应激极为敏感。缺氧、高糖、化学毒物或突变等情况通过抑制蛋白糖基化、引起二硫键错配、减少蛋白质从内质网向高尔基体转运等方式,导致未折叠和/或错误折叠蛋白在内质网内积聚,当超过内质网的处理能力时,能使内质网功能发生改变,称为内质网应激(endoplasmicreticulumstress,ERS)。脂肪组织被视为高度活跃的内分泌器官,能够分泌多种脂肪因子调节能量代谢。当脂肪组织分泌功能紊乱时,脂肪因子表达水平发生改变,参与IR的发生发展。内质网是负责分泌蛋白和膜蛋白合成与翻译后修饰、多肽链正确折叠和装配的重要场所,脂肪细胞的ERS可能影响到脂肪因子的合成与分泌,从而导致IR的发生。
二甲双胍是一种临床常用药物,能明显降低糖尿病患者的血糖,并可以减少发生糖尿病相关血管并发症的危险,减少糖耐量异常患者进展为糖尿病的发生率,并且副作用较小,在糖尿病的预防和治疗中二甲双胍备受重视。随着近年来对二甲双胍降糖及降糖外作用研究的不断深入,其临床应用范围不断拓宽。但迄今为止对二甲双胍是否能在ERS环节干预瓜研究甚少,尤其是对内脏脂肪组织ERS的作用,目前国内外尚无相关研究报道。
本研究通过高脂饮食喂饲法建立IR大鼠模型,观察胰岛素靶组织ERS发生情况,并进一步给予二甲双胍灌胃治疗,评价二甲双胍对内脏脂肪组织ERS程度的影响及对脂肪因子chemerin表达的影响及,探讨内脏脂肪组织ERS在m中的作用及二甲双胍改善IR作用的可能机制。
实验方法：
1.高脂饮食喂饲方法建立IR大鼠模型;
2.清醒状态正常葡萄糖—高血浆胰岛素钳夹实验(hyperinsulinemiceuglycemicclamptest,HECT)、腹腔注射葡萄糖耐量实验(intraperitonealglucosetolerancetest,IPGTT)评估大鼠的胰岛素敏感性;
3.酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)方法测定大鼠血清中胰岛素水平;
4.全自动生化分析仪测定血清总胆固醇(totalcholesterol,TC)、甘油三酯(triglycerides,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-densitylipoproteincholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-densitylipoproteincholesterol,LDL-C)、游离脂肪酸(freefattyacid,FFA)水平;
5.实时荧光定量聚合酶链反应(real-timereversetranscriptionpolymerasechainreaction,real-timeRT-PCR)检测大鼠胰岛素靶组织组织(肝脏、肾周脂肪、骨骼肌)ERS标志物葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulatedprotein78,GRP78)mRNA的表达:
6.Westernblot方法检测大鼠胰岛素靶组织组织中ERS相关蛋白——PKR样ER调节激酶(pancreaticERkinase-likeERkinase,PERK)、真核起始因子α(eukaryoticinitiationfactor2α,eIF2α)及肌醇需酶1α(inositolrequiringenzylne1α,IRE1α)的活化;
7.逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)检测大鼠肾周脂肪组织X盒结合蛋白1(X-boxbindingprotein1,XBP1)mRNA的剪切;
8.斑点免疫印记(Dotblot)方法检测大鼠血清中chemerin水平;
9.Real-timeRT-PCR方法检测大鼠肾周脂肪组织脂肪因子chemerinmRNA表达水平;
10.Westernblot方法检测大鼠肾周脂肪组织脂肪因子chemerin蛋白表达。
实验结果：
(一)高脂饲料喂养大鼠胰岛素靶组织ERS标志分子的表达
1.高脂饲料喂养大鼠10周后,高脂饲料组大鼠肝脏、肾周脂肪组织GRP78mRNA表达较正常饲料组明显增加(P＜0.01),骨骼肌中GRP78mRNA表达水平两组未见明显差异(P＞0.05)。
2.高脂饲料组大鼠肝脏、肾周脂肪组织GRP78蛋白表达较正常饲料组明显增加(P＜0.05,P＜0.01),两组骨骼肌中GRP78蛋白表达水平未见明显差异(P＞0.05)。
3.高脂饲料组大鼠肾周脂肪、肝脏组织PERK、eIF2α、IRE1α磷酸化水平较正常饲料组明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05),两组骨骼肌中上述蛋白的磷酸化水平无明显差异(P＞0.05)。
(二)二甲双胍对大鼠一般状况的影响
各组大鼠实验初始时体重无明显差异(P＞0.05);喂养至第10周,各组大鼠平均体重差别仍无统计学意义(P＞0.05);至第16周,高脂饲料对照组(HF组)大鼠平均体重高于正常饲料对照组(NC组)大鼠的体重均数(P＜0.05),给予二甲双胍干预的高脂饲料治疗组(HM组)大鼠平均体重低于HF组和NC组(P＜0.01)。
喂养至第16周,与NC组相比,HF组大鼠空腹血糖(fastingbloodglucose,FBG)升高(P＜0.05),空腹胰岛素(fastinginsulin,Fins)水平升高(P＜0.01),附睾周围脂肪重量占体重百分比(epididymaladiposeweight/bodyweight,EAW/BW)明显升高(P＜0.01);HM组与HF组相比,FBG水平下降(P＜0.05),Fins降低(P＜0.01),EAW/BW降低(P＜0.01);HM组FBG、Fins、EAW/BW均略高于NC组,但差异无统计学意义(P＞0.05)。
喂养至第16周,检测大鼠血脂水平。与NC组相比,HF组大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C、FFA水平升高(P＜0.01);HM组与HF组相比,TC、TG、HDL-C、LDL-C、FFA水平下降(P＜0.01);HM组TC、TG、HDL-C、FFA水平均略高于NC组(P＜0.05)。
(三)二甲双胍对大鼠胰岛素敏感性的影响
1.大鼠喂养至10周,在二甲双胍治疗前,正常饲料喂养大鼠(N组)与高脂饲料喂养的大鼠(H组)每组随机抽取5只大鼠行HECT。H组大鼠GIR明显低于N组(P＜0.01),说明IR大鼠模型复制成功。
二甲双胍治疗6周后,每组随机抽取5只大鼠行HECT。HF组平均葡萄糖输注率(glucoseinfusionrate,GIR)低于NC组[(13.87±1.45vs24.10±2.87)mg.Kg-1·min-1,P＜0.01],HM组GIR高于HF组[(19.72±2.96vs13.87±1.45)mg·kg-1·min-1,P＜0.01]但低于NC组[(19.72±2.96vs24.10±2.87)nag·kg-1·min-1,P＜0.05]。
2.二甲双胍治疗6周后,所有大鼠均行IPGTT。HF组大鼠糖负荷后葡萄糖耐量实验中血糖曲线下面积(areaundercurve,AUC)大于NC组(P＜0.01);HM组AUC小于HF组(P＜0.01),略大于NC组,但差异无统计学意义(P＞0.05)。
(四)二甲双胍对肾周脂肪组织ERS的影响
1.HF组大鼠肾周脂肪组织ERS标志物GRP78mRNA表达较NC组明显增加(P＜0.01);经二甲双胍治疗6周的HM组大鼠肾周脂肪组织GRP78mRNA表达水平较HF组下降(P＜0.01)。
2.NC组大鼠肾周脂肪组织中XBP1mRNA的剪切后形成的XBP1smRNA几乎无表达,HF组的XBP1smRNA则表达明显,HM组XBP1smRNA表达水平较HF组显著降低。
3.HF组大鼠肾周脂肪组织IRE1α磷酸化水平明显高于其他组(P＜0.01):HM组大鼠肾周脂肪组织IRE1α磷酸化水平较HF组降低(P＜0.01)。
4.HF组、HM组大鼠肾周脂肪组织PERK及eIF2α磷酸化水平高于NC组和NM组(P＜0.01),但HF组和HM组PERK及eIF2α磷酸化水平无明显差别。
(五)二甲双胍对脂肪因子chemerin表达的影响
1.HF组大鼠肾周脂肪组织chemerinmRNA表达水平高于NC组(P＜0.01);HM组chemerinmRNA表达水平较HF组下降(P＜0.05)。
2.HF组大鼠肾周脂肪组织chemerin蛋白质表达水平明显高于NC组(P＜0.01);HM组chemerin蛋白表达水平较HF组降低(P＜0.05),与NC组相比无统计学差异(P＞0.05)。
3.大鼠血清中chemerin水平通过半定量的dotblot方法检测。HF组血清chemerin水平明显高于NC组(P＜0.01);HM组血清chemerin水平较HF组降低(P＜0.05),与NC组相比无统计学差异(P＞0.05)。
4.通过对实验电全部大鼠循环chemerin水平与体重、FBG、Fins、TG、TC、HDL-C、LDL-C、FFA、EAW/BW、AUC进行相关分析发现:大鼠循环chemerin水平与EAW/BW呈显著正相关(r=0.507,P＜0.01),与Fins水平呈正相关(r=0.351,P＜0.01),与TC水平呈正相关(r=0.364,P＜0.01),与TG水平呈正相关(r=0.453,P＜0.01),与HDL-C水平呈负相关(r=-0.314,P＜0.01),与AUC水平呈正相关(r=0.492,P＜0.01)。以血清chemerin水平为应变量,体重、FBG、Fins、TG、TC、HDL-C、LDL-C、FFA、EAW/BW、AUC为自变量进行多元逐步回归分析,有AUC、EAW/BW进入方程(P＜0.01)。偏相关分析在校正TG后,血清chemerin水平与EAW/BW呈正相关(r=307,P＜0.01),与AUC呈正相关(r=0.400,P＜0.01);校正TG和EAW/BW后与AUC呈正相关(r=0.315,P＜0.05)。
结论：
1.长期进食高脂肪含量膳食可以引起IR及中心性肥胖。
2.长期摄入高脂饮食能够引起肝脏、内脏脂肪组织的ERS。
3.二甲双胍能够下调IR大鼠肾周脂肪组织GRP78mRNA水平,提示二甲双胍可能通过改善脂肪组织ERS减轻IR。
4.HM组大鼠肾周脂肪组织IRE1α磷酸化水平较HF组降低,而PERK、eIF2α磷酸化水平并未见明显改变,提示二甲双胍通过影响ERS时IRE1α-XBP1s通路发挥改善胰岛素敏感性的作用。
5.高脂饮食诱导的瓜大鼠肾周脂肪组织chemerin表达水平明显高于正常饲料组,给予药物干预的高脂治疗组大鼠(HM组)肾周脂肪组织chemerin的表达水平低于高脂对照组(HF组),血清中chemerin水平的检测结果与肾周脂肪组织相同。提示二甲双胍可以降低内脏脂肪组织chemerin的表达,这可能是其降低循环chemerin水平的原因。
6.二甲双胍降低循环chemerin水平,可能是其改善IR的又一作用机制。
7.血清chemerin水平与TG、内脏脂肪含量及腹腔葡萄糖耐量实验血糖曲线下面积呈正相关性,说明循环chemerin水平可以反映IR的程度,为临床评估IR程度提供新的生物学指标。