沙门氏菌是一种非常重要的人兽共患病病原菌,主要引起人和动物的发热、肠炎、败血症等多种疾病症状,呈全球性分布。沙门氏菌为胞内侵袭性细菌,能有效呈递抗原,激发抗沙门氏菌和诱导外源蛋白的特异性体液免疫与细胞免疫,并能同时诱导黏膜免疫与全身免疫。近几年,沙门氏菌常通过宿主载体平衡致死系统构建新型疫苗载体。减毒鸡伤寒沙门氏菌疫苗株97A是经转座突变及粗糙变异筛选所获得,本实验室已从安全性、免疫效力和病理组织学等各个方面对97A疫苗株作出评价,研究结果表明,该减毒株具有较好的安全性和免疫效力。本研究旨在研制更加安全的减毒鸡伤寒沙门氏菌97A疫苗株,并将其开发为新型活疫苗载体。以97A为亲本菌,缺失基因组中编码天冬氨酸-β-半乳糖脱氢酶的asd基因,构建asd宿主载体平衡致死系统,用于高效表达外源基因,初步应用该系统表达了红色荧光蛋白基因和新城疫F蛋白基因部分片段,为研制新型载体疫苗奠定了基础。1.减毒鸡伤寒沙门氏菌97A△a sd缺失株的构建与鉴定为了研制更加安全的鸡伤寒沙门氏菌弱毒株,并使其开发为活疫苗载体,本研究构建了鸡伤寒沙门氏菌97A△asd缺失株,并以此建成宿主载体平衡致死系统。根据鸡伤寒沙门氏菌asd基因已发表的基因序列,设计并合成了2对引物,PCR方法扩增了asd上下游序列。通过氯霉素抗性基因替代asd基因中间片段,构建重组自杀性质粒,与鸡伤寒沙门氏菌野生菌接合转移,两步法筛选△asd缺失株。结果表明,△asd缺失株被成功构建,命名为97A△asd缺失株,其表型、生长特性及生化特征与野生菌保持一致。基因互补试验结果显示,该突变株能稳定表达红色荧光蛋白,即该宿主载体平衡致死系统能高效表达外源基因,为鸡伤寒沙门氏菌载体疫苗的进一步研究奠定了基础。2.新城疫病毒F基因部分片段在减毒鸡伤寒沙门氏菌97A△a sd缺失株中的表达以重组质粒pVAX1-F为模板扩增594 bp的NDV-F基因部分片段,亚克隆至原核表达质粒pYA3334中,获得X6212(pYA3334-F)。从大肠杆菌X6212提取重组质粒pYA3334-F,并将其电转化沙门氏菌中间宿主X3730进行甲基化处理,最后将甲基化的原核表达质粒pYA3334-F电转化X4550,SDS-PAGE电泳和免疫试验检测到F表达。将验证正确的重组质粒pYA3334-F电转化97A△asd缺失株,SDS-PAGE电泳检测F表达。携带F的重组菌97A(pYA3334-F)及对照菌97A(pYA3334)以1×109 CFU/只肌注免疫雏鸡,结果表明该重组菌是安全的,免疫组产生了针对F蛋白的IgG抗体,二免二周平均抗体效价至1:200,三免二周平均抗体效价至1:400。上述结果为进一步研制新城疫新型疫苗奠定了基础。