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天然免疫是天然免疫系统为自我成分与非自我成分的区分识别奠定了免疫应答与调控的基础,干扰素调节因子3(Interferon regulatory factor3,IRF3)是干扰素调节因子家族的主要成员之一,也是天然免疫信号通路中重要的干扰素调节因子,当DNA病毒感染时可激活STING/TBK1/IRF3天然免疫信号通路,最终激活Ⅰ型干扰素(Type Ⅰ interferon,IFN)的表达。本试验使用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建IRF3基因稳定敲除猪肾上皮PK15细胞系。构建pIRF3-sgRNA重组质粒与慢病毒包装载体共转染至HEK293T/17细胞,收获慢病毒并感染PK15猪肾上皮细胞,经嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7酶切鉴定筛选基因编辑效率较高的多克隆细胞,然后通过有限稀释法获得PK15-IRF3-/-单克隆稳定细胞系。为验证IRF3基因稳定敲除细胞系是否构建成功,首先使用荧光显微镜和流式细胞术观察PRV-GFP病毒在感染PK15-WT以及PK1 5-IRF3-/-细胞后0h、6h、12h、24 h、36h、48 h病毒复制的差异,其次TCID50检测PRV-QXX病毒在感染PK15-WT以及PK15-IRF3-/-细胞后0 h、6h、12h、24 h、36h、48 h病毒滴度,再次Western Blot检测PRV-QXX病毒在感染PK15-WT以及PK1 5-IRF3-/-细胞后0h、6h、12h、24 h、36h、48 h病毒相关蛋白gE的表达,最后荧光定量PCR检测PK15-WT以及PK15-IRF3-/-细胞感染PRV-QXX后0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24 h、36h、48 h后病毒基因TK以及IFN-β mRNA的表达。试验结果表明,IRF3-sgRNA重组质粒构建成功。用构建成功的重组质粒包装慢病毒去感染PK15细胞经T7酶切检测证实对IRF3基因显著编辑。下一步获取单克隆细胞并进行测序鉴定,获得稳定敲除IRF3猪肾上皮细胞单克隆细胞系。通过荧光显微镜和流式细胞术观察结果显示,PK15-WT以及PK1 5-IRF3-/-细胞系感染PRV-GFP后PK1 5-IRF3-/-细胞荧光强度随时间不断增加且明显强于PK15-WT细胞。感染PRV野毒(PRV-QXX)后PK15-IRF3-/-病毒滴度随时间增加明显强于PK15-WT细胞,PRV病毒相关蛋白gE蛋白表达水平随时间增加明显强于PK15-WT细胞。在mRNA水平检测PK15-WT以及PK15-IRF3-/-细胞感染PRV-QXX后随时间增加病毒相关基因TK在PK15-IRF3-/-细胞中的表达明显高于PK15-WT细胞,PRV-QXX感染后PK15-WT细胞中IFN-β mRNA会随着时间增加显著增高,但PK15-IRF3-/-细胞中IFN-β mRNA则无明显变化。上述结果表明,IRF3在PRV复制过程中发挥着重要作用,敲除IRF3后显著促进PRV的增殖。以上结果表明IRF3基因敲除猪肾上皮细胞系构建成功,这为深入研究IRF3的功能提供了有效工具。