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研究背景与目的骨肉瘤是最常见的原发恶性骨肿瘤,尽管骨肉瘤的手术切除与重建技术、化疗、放疗技术已经取得了较多的进步,但是目前骨肉瘤患者的生存率仍不理想。在诊断时既已发生其它器官的转移或初次治疗后的复发是导致预后不良的主要因素。对于未转移骨肉瘤患者,其5年无病生存率约为70%,而对于转移性骨肉瘤患者的5年生存率则在15%至30%之间。骨肉瘤的治疗水平已达到平台期。因此,有必要进一步研究骨肉瘤发生发展的分子机理,并确定用于骨肉瘤治疗的新治疗靶标,突破骨肉瘤目前的治疗瓶颈。RNA N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修饰是哺乳动物转录产物mRNA中最丰富的内部修饰,且其与肿瘤的发生发展相关。甲基转移酶样蛋白3(Methyltransferase like protein 3,METTL3)是被最早报道的 m6A 甲基转移酶,在癌症进展中起着至关重要的作用。然而,METTL3是否与骨肉瘤的发展相关,以及其可能涉及的机制尚不清楚。在本研究中,我们旨在探索METTL3在骨肉瘤细胞增殖及侵袭中的作用及其潜在机制。方法我们首先使用免疫组织化学染色的方法检查骨肉瘤手术切除标本中METTL3的表达水平。然后分别使用RT-PCR技术和Western blot技术检测了 4种骨肉瘤细胞系(HOS、SAOS-2、U20S和MG63)中METTL3的mRNA和蛋白表达基础水平,并进行了免疫荧光分析,确定了 METTL3的位置;为了研究METTL3在骨肉瘤细胞中的功能作用,我们分别构建了 siRNA-METTL3用于干扰METTL3的内源表达和pcDNA3.1-METTL3用于过表达进行后续研究。利用上述构建的细胞系,通过分析METTL3 mRNA 和蛋白表达,确定 siRNA-METTL3 和 pcDNA3.1-METTL3 的有效性,并进一步检测经过干扰和过表达后的细胞RNA m6A甲基化水平的变化。CCK8检测和细胞克隆实验分别用来测定METTL3对骨肉瘤细胞分裂增殖能力和细胞的集落形成能力的影响;使用Transwell法测定METTL3对骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力的影响;流式细胞技术分析METTL3对骨肉瘤细胞凋亡比例的影响。为研究METTL3参与这些细胞过程的分子机制,我们对MG63细胞进行转录组测序(RNA-seq),分析METTL3敲低后mRNA转录水平变化情况,根据测序结果挑选出ATAD2作为METTL3的下游靶基因继续进行研究。接下来,我们构建了ATAD2敲低和过表达细胞系用于研究ATAD2在骨肉瘤细胞中的生物学功能。为研究METTL3调节ATAD2的机制,我们对MG63细胞进行了 RNA m6A甲基化测序(m6A-seq),分析METTL3敲低后m6A mRNA甲基化水平的变化情况,进一步探索METTL3调节ATAD2的机制。结果免疫组织化学染色结果显示METTL3在骨肉瘤中较瘤旁组织明显高表达。METTL3 mRNA在U20S细胞中水平最低,而在SAOS-2和MG63细胞中则较高。METTL3蛋白表达水平与mRNA一致,即在U20S细胞中表达最低,而在SAOS-2和MG63细胞中表达较高。METTL3表达水平较低的U20S细胞用于后续的METTL3过表达实验,而METTL3表达水平较高的SAOS-2和MG63细胞则用于后续干扰表达实验;免疫荧光技术分析发现METTL3在骨肉瘤细胞的细胞质和细胞核中均有分布;为了研究METTL3在骨肉瘤细胞中的功能作用,我们分别构建了 siRNA-METTL3用于干扰METTL3的内源表达和pcDNA3.1-METTL3用于过表达研究;在SAOS-2和MG63细胞中转染siRNA-METTL3后,与空白对照和阴性对照相比METTL3 mRNA和蛋白水平下调。在U20S细胞中转染pcDNA3.1-METTL3后,与空白对照和阴性对照相比,METTL3 mRNA和蛋白水平上调;当敲低METTL3时,SAOS-2和MG63细胞中的RNA m6A甲基化水平均显著降低。在U20S细胞中过表达METTL3后,RNA m6A甲基化水平显著上升。敲低METTL3后,SAOS-2和MG63细胞的增殖能力、集落形成能力、迁移和侵袭能力被明显抑制。过表达METTL3后,U20S细胞的增殖能力、集落形成能力、迁移和侵袭能力没有发生明显改变。敲低METTL3后,SAOS-2和MG63细胞的凋亡比例显著增加。过表达METTL3后,U20S细胞的凋亡比例没有受到影响。METTL3敲低后,SAOS-2和MG63细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达均显著下调,而促凋亡蛋白Bax和Caspase 3的表达明则显上调。过表达METTL3后,U20S细胞内上述蛋白质的表达没有显著变化。MG63细胞转录组测序技术显示,METTL3敲低后有578个基因转录水平被上调,而另外481个基因的转录水平被下调,其中三磷酸腺苷酶家族蛋白2(ATPase family AAA domain-containing protein 2,ATAD2)表达下降明显。我们选择将ATAD2作为METTL3的下游靶基因继续进行研究。ATAD2敲低后,SAOS-2和MG63细胞的增殖能力、侵袭能力受到抑制。ATAD2的过表达则促进了 SAOS-2和MG63细胞的增殖和侵袭能力。敲低METTL3后,过表达ATAD2无法发挥对骨肉瘤细胞增殖和侵袭的促进作用。MG63细胞m6A-seq显示,METTL3敲低后ATAD2 mRNA的甲基化水平下降,提示METTL3可通过m6A修饰调节ATAD2发挥促进骨肉瘤细胞增殖和侵袭的作用。结论1.METTL3在骨肉瘤细胞核和细胞质中均有分布;2.敲低METTL3后,骨肉瘤细胞的增殖和侵袭能力显著降低;3.METTL3可通过调节Bcl-2/Bax信号通路和Caspase级联反应来抑制骨肉瘤细胞的凋亡;4.ATAD2促进骨肉瘤细胞增殖和侵袭;5.METTL3可能通过m6A修饰调节ATAD2来促进骨肉瘤细胞的增殖和侵袭。