研究背景：尽管结直肠癌患者的预后较其他消化道肿瘤好，但仍有相当一部分病例术后复发或转移。手术只能清除肉眼所见肿块，放疗及化疗也不能将肿瘤细胞斩尽杀绝，这三种传统治疗方法的实施均对机体的抗肿瘤免疫功能造成一定的抑制和损伤。而免疫治疗作为新兴的肿瘤治疗的第四大手段已经在实体肿瘤治疗中使患者受益。荷载肿瘤抗原的树突状细胞（DendriticCells, DCs）、树突状细胞致敏的T淋巴细胞（DC-activated T, DC-AT）和活化的T淋巴细胞（activated T cells, ATC）作为免疫治疗的重要部分，已经在临床治疗中得到应用，但联合三种免疫细胞在围手术期通过不同路径不同时间序贯回输体内治疗结直肠癌未见临床报道。T淋巴细胞作为三种免疫细胞联合治疗的主要效应细胞，可特异性识别肿瘤，呈克隆化扩增，并在体内形成免疫记忆，可介导持久抗肿瘤特异性免疫。关于T淋巴细胞回输人体内后通过克隆化扩增和形成免疫记忆来重建抗肿瘤特异性免疫的相关机制亦是未见报道。目的：通过前瞻性临床队列研究观察三种免疫细胞联合治疗结直肠癌的临床效应，建立动态观察结直肠癌患者免疫治疗前及治疗后T细胞受体（Tcell receptor, TCR） CDR3(Complementary determining region, CDR)区基因克隆化程度和T淋巴细胞免疫记忆状态的技术平台，评价特异性抗肿瘤免疫功能重建程度，探讨免疫细胞抗肿瘤效应的长效机制。方法：1）选取2005年7月至2011年7月解放军总医院253例行结直肠癌根治术的II、III和IV期患者，按照治疗方式不同，将181例单纯术后辅助化疗患者设为对照组，72例术后辅助化疗联合DCs、DC-AT和ATC免疫治疗患者设为免疫治疗组。对两组患者定期随访，截至于2012年7月。采用Kaplan–Meier生存分析法比较两组5年生存率并绘制生存曲线，进一步分析免疫治疗频次对免疫治疗疗效的影响，并观察免疫细胞治疗过程中有无不良反应。2）选取3例进行免疫治疗的结直肠癌患者，采集免疫治疗前及治疗后3个月的外周血。以流式细胞术检测外周血中央型记忆T细胞和效应型记忆T细胞比例，评估免疫治疗后体内形成的T细胞免疫记忆状态；用磁珠从外周血分离的PBMC中分离CD4+、CD8+T细胞，分别提取CD4+/CD8+T细胞中RNA并进行逆转录，应用TCR CDR3多态性及克隆化可视化和定量化检测技术对逆转录产物进行巢式PCR，对产物进行基因扫描，获得免疫治疗前后TCRCDR3基因扫描谱；同时对PCR产物进行电泳，获得TCR CDR3基因电泳谱，选取免疫治疗前后持续表达的Vβ2和治疗后出现的Vβ11单克隆条带进行切胶纯化；将纯化的PCR产物进行TA克隆及细菌转化，通过蓝白筛选活的克隆菌落培养后提取质粒，对含有目的片段的质粒进行基因测序,采用Vector NTIversion11和IMGT/V-QUEST对序列进行分析。结果：1）免疫治疗组3年和5年生存率较对照组均显著升高（87.07%VS74.80%；75.63%VS67.81%，P<0.05）。2）免疫治疗组中治疗频次≥3个周期患者5年生存率较<3个周期的患者显著升高（82.10%VS69.90%，P<0.05）。3）免疫细胞治疗前（亦是手术前荷瘤状态）外周血TCR CDR3基因谱显示：3例结直肠癌患者均表达CD8+TCR Vβ2、Vβ3、Vβ5、Vβ8和Vβ22单克隆基因条带，表明初诊时结直肠癌患者体内预存特异性抗肿瘤克隆化T细胞。4）对比分析免疫细胞治疗前及治疗后的CD8+TCR CDR3基因谱显示：3例结直肠癌患者治疗前后持续共表达单克隆Vβ2，而Vβ3、Vβ5、Vβ8和Vβ22则呈现恢复多态性趋势，说明结直肠癌患者本身存在特异性的抗肿瘤克隆化T细胞，免疫细胞治疗后预存免疫状态得以保持。治疗后3例患者均出现了单克隆Vβ11，即免疫细胞治疗诱导产生了新的克隆化T细胞。5.免疫治疗后结直肠癌患者外周血中CD8+中央型记忆T细胞比例较治疗前显著升高，即抗肿瘤特异性T细胞比例显著升高。5）3例结直肠癌患者外周血TCRVβ2克隆化CDR3区第1-3位共表达氨基酸序列为CSA，而Vβ11共表达氨基酸序列为CAS，D区和J区存在部分共表达的氨基酸序列。结论：1）围手术期免疫细胞治疗可以显著提高结直肠癌术后3年和5年生存率。2）免疫细胞治疗在保持患者体内预存抗肿瘤免疫的同时，诱导产生了新的克隆化CD8+T细胞，同时形成免疫记忆，重建抗肿瘤特异性免疫。