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背景与目的:白介素(IL)-27由EBI3和IL-27p28两个亚单位组成,属于IL-6/IL-12家族成员,主要由活化的单核细胞及其衍生的树突状细胞和巨噬细胞产生。IL-27受体(IL-27R)由IL-27Rα和gp130组成,表达于包括树突状细胞在内的多种免疫细胞和结构细胞。其中,IL-27Rα是识别IL-27信号的特异性组成部分。既往研究证实,IL-27参与哮喘发病,但作用与机制尚未完全阐明。因此,本研究首先利用IL-27Rα基因敲除(IL-27Rα-/-)小鼠明确IL-27在哮喘气道炎症和气道高反应性中的作用。树突状细胞(DC)是诱导哮喘过敏原特异性免疫反应的关键始动者。CD39是表达于DC等细胞膜表面的胞外核苷酸水解酶,可将ATP逐步水解为ADP和AMP,抑制危险信号ATP的促炎效应。NLRP3炎性小体是固有免疫中重要的模式识别受体(PRR)家族成员,由NLRP3、衔接蛋白ASC和效应蛋白Caspase-1组成。ATP等内源性危险信号可激活NLRP3炎性小体,并大量释放IL-1β、IL-1.8等促炎因子,加剧Th2和Th17细胞极化。新近研究发现,IL-27与树突状细胞CD39/ATP轴在自身免疫性脑脊髓炎(EAE)动物模型中密切相关,IL-27抑制EAE病情进展的作用部分是通过调控树突状细胞CD39表达水平而实现的。据此推测,IL-27与CD39在哮喘环境中可能也存在类似关联。因此,在前期基础上,本研究重点探讨IL-27对哮喘小鼠树突状细胞CD39/ATP轴和NLRP3炎性小体表达与功能的影响,以期探索IL-27调控哮喘小鼠气道炎症和气道高反应性的潜在性机制。方法:(1)第一部分:选择6-8周龄以C57BL/6为背景的IL-27Rα-/-雌性小鼠和野生型(WT)C57BL/6雌性小鼠,采用卵清蛋白(OVA)致敏和激发模式建立急性哮喘模型,并以IL-27Rα-/-正常小鼠和WT正常小鼠作对照。末次激发48小时后,采用小动物体描仪检测各组小鼠的气道阻力和动态肺顺应性;苏木精-伊红染色(HE)和过碘酸-雪夫氏染色(PAS)分别观察小鼠肺组织炎性细胞浸润和杯状细胞增生情况;免疫组化法观察Muc5AC黏蛋白在小鼠肺组织的表达部位与表达水平;支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞经瑞氏-吉姆萨(Wright-Giemsa)染色后进行分类计数;ELISA法检测血清中总免疫球蛋白E(IgE)和OVA特异性IgE(OVA-IgE)含量,以及 BALF 中 Thl(IFN-y)、Th2(IL-4、IL-5、IL-13)、Th17(IL-17A)和 Treg(IL-l0)细胞相关因子水平;实时定量PCR(qPCR)检测肺组织Thl(T-bet)、Th2(GATA-3)、Th17(RORyt)和Treg(Foxp3)细胞相关转录因子水平。(2)第二部分:同前建立IL-27Rα-/-和WT小鼠哮喘模型,qPCR或Western blot分别检测小鼠肺组织CD39和NLRP3 炎性小体组分 NLRP3、ASC、pro-Caspase-1 和 Caspase-1 的 mRNA 或蛋白表达水平;ATP检测试剂盒和ELISA法分别测定BALF中ATP浓度和IL-lβ、IL-18因子含量。(3)第三部分:同前建立IL-27Rα-/-和WT小鼠哮喘模型,流式细胞术检测小鼠肺树突状细胞CD39表达水平;同时,体外分离IL-27Rα-/-小鼠和WT小鼠骨髓单个核细胞,以IL-4和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导分化为骨髓来源的树突状细胞(BMDC),通过qPCR或Western blot分别检测rmIL-27或(和)LPS干预下树突状细胞CD39分子、炎性小体组分NLRP3、ASC、pro-Caspase-1和Caspase-1的mRNA或蛋白表达水平,利用ATP检测试剂盒测定培养液上清中ATP含量。最后,通过Western blot检测外源性IL-27重组蛋白(rmIL-27)对树突状细胞JAK/STAT信号通路各组分表达水平的影响。结果:(1)IL-27Rα基因敲除加重哮喘小鼠气道高反应性和气道炎症特征,具体表现为:与WT哮喘小鼠比较,IL-27Rα-/-哮喘小鼠气道阻力增高,肺组织炎性细胞浸润加重,杯状细胞大量增生,气道上皮周围Muc5AC表达增强,BALF细胞总数和嗜酸性粒细胞等分类计数增加,血清总IgE和OVA-IgE含量增加,BALF中IL-4、IL-5、IL-13和IL-17A 水平升高,肺组织中转录因子GATA-3和RORyt表达增加,而T-bet和Foxp3表达降低。(2)与WT哮喘小鼠比较,IL-27Rα-/-哮喘小鼠肺组织CD39 mRNA和蛋白表达水平下降,NLRP3炎性小体组分NLRP3、ASC和Caspase-1表达增加,BALF中ATP浓度和IL-1β、IL-18含量显著升高。(3)与WT哮喘小鼠比较,IL-2Rα-/-哮喘小鼠肺树突状细胞CD39表达降低。与WT小鼠骨髓诱导的树突状细胞(WT-BMDC)比较,IL-27Rα-/-小鼠骨髓诱导的树突状细胞(IL-27Rα-/--BMDC)CD39表达水平下降,而培养液上清中ATP含量显著增加。IL-27Rα-/--BMDCNLRP3炎性小体组分NLRP3、ASC和Caspase-1表达也明显高于WT-BMDC。外源性rmIL-27促进WT-BMDC表达CD39,降低培养液中ATP含量,诱导WT-BMDC NLRP3炎性小体组分NLRP3、ASC和Caspase-1表达水平下调。另外,rmIL-27干预WT-BMDC能引起JAK/STAT信号通路中磷酸化的JAK1、JAK2、STAT1和STAT3表达增加。结论:IL-27Rα基因敲除加重哮喘小鼠气道炎症和气道高反应性,其可能的机制是IL-27功能缺陷导致哮喘小鼠树突状细胞CD39表达水平降低,胞外ATP含量剧增,引起树突状细胞NLRP3炎性小体活化,大量释放促炎因子IL-1β和IL-18,加剧Th2和Th17反应偏倚。