世界卫生组织(WHO)规定,夫妇同居1年以上,未采用任何避孕措施,由于男方因素造成女方不孕者,称为男性不育。男性不育受遗传,环境等多因素影响,约60%-75%的男性不育患者为特发性精液异常,但其原因尚不完全清楚。基因印记是特定基因的一对等位基因发生差异性的表达,机体仅表达来自亲本一方的等位基因,而另一方保持沉默。这一过程是由DNA甲基化介导。在正常精子发生期间,母系印记基因SNRPN甲基化标记的擦除和父系印记基因H19的重建在生殖细胞进入减数分裂前就已完成。父本甲基化印记在减数分裂期间和后续的男性生殖细胞分化期间维持。印记擦除、印记的重新建立和印记的保留错误都会导致印记基因紊乱。本研究围绕男性不育问题,通过亚硫酸氢盐修饰后测序法,对不育男性精子父系印记基因H19及母系印记基因SNPRN甲基化状态进行研究,并对部分CpG位点进行了限制性内切酶分析,以探讨男性不育的表观遗传学病因和发病机制,以及男性不育的表观遗传学因素对辅助生殖技术安全性的影响。本研究表明, H19基因及SNRPN基因在各组中绝大多数为正确的印记状态,个别存在散在的CpG位点印记改变。ART在临床上用于治疗严重少、弱、畸形精子症可能仍是一种安全而有效的手段,但应注意到其子代发生印记疾病的潜在风险,严格按照ART适应症进行治疗。有趣的是,严重弱精子症组H19基因和严重畸形精子症组SNRPN基因有一个克隆出现甲基化异常的临界状态。严重少精子症和严重弱精子症患者H19基因9号CpG位点,CTCF结合位点6以及SNRPN基因16号CpG位点可能存在比正常精液男性和严重畸形精子症男性更容易发生甲基化状态异常的趋势。这可能是严重少、弱、畸形精子症男性较差的精液质量以及不育的原因之一。第一部分精液样本处理及DNA甲基化检测技术的建立【目的】1)建立亚硫酸氢盐修饰后测序技术,对不育男性精子印记基因DNA甲基化状态进行检测。2)优化实验条件,选择合适的测序方法,为后续实验奠定基础。【方法】1)对样本进行精液分析和精子形态学分析,密度梯度离心法制备精液。提取精液基因组DNA。2)对基因组DNA行亚硫酸氢盐处理,随后行半巢式PCR,第一轮反应产物纯化后再进行第二轮反应。3)将PCR产物进行纯化,与pCR?2.1-TOPO?载体连接及转化,并行菌液PCR鉴定阳性克隆。4)同时送PCR产物及15个阳性克隆菌液进行测序,用Vector NTI Suite 8软件对测序结果进行序列分析。【结果】1)所有样品的DNA OD260/OD280值均介于1.7～1.9之间,表明纯度较好,无蛋白质及RNA污染。2)以未经纯化的第一轮PCR产物为模板行第二轮PCR反应,电泳结果显示有非特异性条带存在。而以纯化后的PCR产物为模板进行第二轮PCR反应,电泳结果显示条带单一,特异。3) PCR产物直接测序,前半部分序列丢失约40bp, 1号CpG位点甲基化状态信息丢失。每例标本只有一个测序结果,会出现CpG位点的部分甲基化状态。4)挑取15个克隆进行测序,序列无丢失,18个CpG位点甲基化状态信息均完整15个克隆CpG位点甲基化状态有所不同,显示出此样本的平均甲基化状态。【结论】1)用Exonuclease I与FastAP? Thermosensitive Alkaline Phosphatase对半巢式PCR第一轮PCR反应产物进行纯化,能够去除未掺入PCR产物的引物和核苷酸,使第二轮PCR反应无非特异性扩增,电泳目的条带单一,特异。便于后续的分子克隆操作。2) PCR产物成功与pCR?2.1-TOPO?载体连接并转化,菌液PCR鉴定显示绝大多数克隆为阳性结果,通过亚硫酸氢盐修饰后测序法成功进行精子DNA甲基化状态检测。3) PCR产物直接测序会丢失部分序列,使CpG位点甲基化状态信息丢失,而克隆测序则不会造成序列丢失,CpG位点甲基化状态信息完整。4) PCR产物直接测序仅能反应标本总体的甲基化状态,会出现CpG位点的部分甲基化状态。而每个标本挑取15个克隆进行测序,则能较好地反应该样本的平均甲基化状态。5) PCR产物克隆测序是检测不育男性印记基因DNA甲基化状态的合适方法。第二部分不育男性精子父系及母系印记基因甲基化状态研究【目的】1)研究不育男性精子父系印记基因H19及母系印记基因SNPRN甲基化状态2)探讨男性不育的表观遗传学病因和发病机制及男性不育的表观遗传学因素对辅助生殖技术安全性的影响。【方法】1)对样本进行精液分析和精子形态学分析,密度梯度离心法制备精液。提取精液基因组DNA。2)对基因组DNA行亚硫酸氢盐处理,随后行半巢式PCR或PCR反应。3)将PCR产物进行纯化,与pCR?2.1-TOPO?载体连接及转化,并行菌液PCR鉴定阳性克隆。4)每例标本送15-20个阳性克隆菌液进行测序,用Vector NTI Suite 8软件对测序结果进行序列分析。5)根据测序结果,挑选出H19基因7号、9号CpG位点,SNRPN基因16号CpG位点甲基化及未甲基化的克隆,提取质粒DNA并行PCR反应。6) H19 7号CpG位点及SNRPN 16号CpG位点用HhaⅠ进行酶切。H19 9号CpG位点用TaqⅠ进行酶切,电泳鉴定酶切结果。7)采用SPSS 16.0软件进行统计学分析【结果】1)各组H19基因大多数为甲基化状态,有散在的CpG位点未甲基化,但未出现CpG位点低甲基化及完全未甲基化。严重弱精子症组中有一个克隆出现8个CpG位点未甲基化,但尚不能达到低甲基化标准(>9个CpG位点呈未甲基化)。2)各组SNRPN基因则与H19基因相反,大多数为未甲基化状态,有散在的CpG位点甲基化。正常精液组中有一个克隆出现20个CpG位点呈甲基化的高甲基化状态(>11个CpG位点呈甲基化),其余克隆未见CpG位点的高甲基化及完全甲基化。严重畸形精子症组有一个克隆出现9个CpG位点甲基化,但尚不能达到高甲基化标准。3)严重畸形精子症组H19基因CpG位点完全甲基化率显著低于严重少精子症组和严重弱精子症组。4)严重少精子症组H19基因7号位点未甲基化率显著低于正常精液组和严重畸形精子症组。5)严重少精症组及严重弱精子症组H19基因9号CpG位点未甲基化率、CTCF结合位点6 3个或3个以上CpG位点未甲基化率,SNRPN基因16号位点甲基化率高于正常精液组及严重畸形精子症组,但差异无统计学意义。6)限制性内切酶分析与克隆测序分析结果相一致。质粒PCR产物电泳显示为未切开的未甲基化条带及切开的甲基化条带。样本PCR产物在H19基因7号、9号CpG位点呈切开的甲基化条带,在SNRPN基因16号CpG位点呈未切开的未甲基化条带。7)各组标本非印记基因LINE-1均呈相似的高甲基化状态,表明这些标本的总DNA甲基化正常。【结论】1) H19基因及SNRPN基因在各组中绝大多数为正确的印记状态,个别存在散在的CpG位点印记改变。2)正常精液组中有一个克隆出现SNRPN基因的高甲基化状态,表明正常精液男性中也可见到印记基因的甲基化异常。3)严重弱精子症组H19基因和严重畸形精子症组SNRPN基因有一个克隆出现临界异常的甲基化状态,可能与弱精子症和畸形精子症不育的原因有关。4)严重少精子症组大多数CpG位点以及CpG 7号位点都是正常的甲基化状态。5) ART在临床上用于治疗严重少、弱、畸形精子症可能仍是一种安全而有效的手段,但应注意到其子代发生印记疾病的潜在风险,严格按照ART适应症进行治疗。6)严重少精子症和严重弱精子症患者H19基因9号CpG位点,CTCF结合位点6以及SNRPN基因16号CpG位点存在可能比正常精液男性和严重畸形精子症男性更容易发生甲基化状态异常的趋势。这些位点的异常甲基化状态可能是严重少精子症和严重弱精子症男性较差的精液质量以及不育的原因之一,提示仍然需要对配子自身印记状态以及对胚胎印记的影响进行进一步研究。7)各组标本非印记基因LINE-1均呈相似的高甲基化状态,表明这些标本的总DNA甲基化正常,不育男性印记基因甲基化状态的改变是特异的,与精子质量异常有关。