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本实验室已有研究证明：低浓度镉(cadmium, Cd;<10μM)可以诱导WRL-68细胞自噬,并不诱导WRL-68细胞凋亡。虽然目前已明确溶酶体参与细胞自噬,但是镉诱导WRL-68细胞自噬过程中溶酶体功能活性是如何被调控的尚不明确。本研究旨在探究镉诱导WRL-68细胞自噬过程中影响溶酶体功能活性的主要因素。首先分析镉诱导WRL-68细胞自噬过程中溶酶体的活性；其次分析WRL-68细胞自噬过程中溶酶体的功能活性与自噬体-溶酶体融合的关系；然后分析溶酶体酸性与溶酶体功能活性的关系；最后分析胞内钙离子浓度与溶酶体功能活性之间的关系。本实验运用细胞培养、透射电子显微镜、Western blot、激光共聚焦和荧光显微镜等细胞生物学实验技术,通过对低浓度镉(<10μM)诱导WRL-68细胞自噬过程中LC3B-Ⅱ/Ⅰ和Cathepsin L表达量分析与LAMP2与GFP-LC3共定位分析来研究溶酶体功能活性在镉诱导WRL-68细胞自噬过程的作用。具体实验结果如下：1.镉诱导WRL-68细胞自噬过程中溶酶体活性分析WRL-68细胞暴露于低浓度CdCl2(<10μM)12h,引起细胞自噬。将WRL-68细胞暴露于低浓度镉后,WRL-68细胞形态基本完好,但发生自噬。在透射电子显微镜镜下观察到细胞内自噬泡增加：然而当加入自噬抑制剂3-MA后,检测到Cathepsin L和LC3B-Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达水平降低。由此得出WRL-68细胞内自噬体的形成影响着溶酶体的功能活性,抑制自噬体形成时,溶酶体的活性也下降。2.溶酶体功能活性与自噬体-溶酶体融合关系分析WRL-68细胞暴露于低浓度镉发生自噬,同时自噬体溶酶体融合增加；但联合加入TG时,自噬体溶酶体融合减少。加入TG后降低了Cathepsin L的表达量,LAMP2与GFP-LC3的共定位明显减少,但LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表达量却增加。因此溶酶体的活性依赖于自噬体和溶酶体的融合,当抑制WRL-68细胞内自噬体-溶酶体的融合,溶酶体活性降低。3.溶酶体酸性与溶酶体的功能活性关系分析WRL-68细胞暴露于低浓度镉诱导发生自噬。用LysoTracker Red染色,当WRL-68细胞中加入Cd时,LysoTracker染色增加,说明溶酶体酸性增加；但联合加入CQ时,LysoTracker染色减少,说明溶酶体酸性降低。加入CQ后,Cathepsin L的表达量降低,但LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达量增加,LAMP2与GFP-LC3共定位却减少。因此在WRL-68细胞中溶酶体的功能活性与溶酶体的酸性有关,当溶酶体的酸性降低时,溶酶体的功能活性也随之下降。4.胞内钙离子浓度与溶酶体功能活性关系分析WRL-68细胞暴露于低浓度镉发生自噬。当WRL-68细胞暴露于8μM Cd时,LysoTracker荧光强度增加,联合加入CQ时荧光强度降低,然而在联合加入2-APB时荧光强度并没有多大的变化。在联合加入CQ或2-APB时胞内钙离子浓度降低GFP-LC3与LAMP2融合也减少。酸性、细胞内Ca2+浓度和Cathepsin L的表达量降低,LAMP2与GFP-LC3的共定位也明显减少,但LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达量增加。在WRL-68细胞中溶酶体的功能活性与胞内Ca2+之间会相互影响,溶酶体的酸性对胞内Ca2+的浓度水平影响较大,而胞内Ca2+浓度对溶酶体的酸性影响较小。本研究在WRL-68细胞暴露于低浓度Cd(<10μM)发生自噬。细胞自噬过程中溶酶体功能活性增强,且自噬体-溶酶体融合、溶酶体的酸性和细胞内钙离子都会影响溶酶体的功能活性。