在许多蛋白中，前导肽（propeptide，pro）作为分子内分子伴侣，可以协助蛋白质的折叠和正确的表达。当前导肽发生变化时，同一编码基因的肽链可以折叠成具有不同空间结构、底物特异性及其它催化特性的构象，形成全新的突变蛋白。米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucor miehei lipase，RML）是一种非常有潜力应用于植物油脂转化的脂肪酶，具有常见的 preproenzyme 型前导肽序列，由于RML前导肽的功能及前导肽对RML别构调控机理尚未清楚，无法通过理性设计对前导肽进行改造，达到高效改善RML性能的目的。本文通过RML前导肽的替换、突变及片段缺失实验，研究了前导肽的功能及前导肽对RML结构的调控机理，同时获得活性及稳定性均提高的新型突变酶。
　　首先，采用同源但不同种属的脂肪酶前导肽来替换RML前导肽，证明了前导肽区域对RML的性质有很强的影响，前导肽中保守性残基可能决定了脂肪酶空间结构的形成，而前导肽其他部分的变化又使酶表现出多样化的催化性质。将华根霉脂肪酶（Rhizopus chinensis lipase, RCL）和米根霉脂肪酶（Rhizopus oryzae lipase, ROL）的前导肽区域替换RML前导肽，两种新型RML在毕赤酵母中成功表达。结果显示，新型RML仍具有生物学活性，但结构以及酶学性质发生改变。与野生型RML相比，前导肽的变化增加了RCLpro-RML和ROLpro-RML空间结构的整体柔性，RCLpro-RML和ROLpro-RML的活性分别比来自野生型前导肽的RML的活性高3.4倍和2.0倍，但稳定性降低。
　　通过前导肽的突变，获得了活性、热稳定性及甲醇稳定性均优于野生型RML的突变脂肪酶，研究发现，酶性质的改变可能与前导肽突变位点位于保守区域及其残基亲水性的变化有关，并验证了突变残基亲水性的增强有利于促进RML前导肽与成熟肽的相互作用，对酶活产生正面的影响。利用易错 PCR 构建RML 前导肽突变文库，经筛选获得三个位于前导肽保守型区域的突变位点Ser8、Pro35、Pro47；再通过组合突变获得了7个结构、活性及稳定性发生变化的突变RML。其中，突变酶AB的活性、热稳定性及甲醇稳定性均优于野生型RML；三个突变氨基酸位点进行饱和突变，获得了9种新型高活性RML突变酶，发现替换后的氨基酸大多为亲水性的氨基酸，或者多点突变中存在亲水性增强的氨基酸残基，验证了这三个位点氨基酸亲水性的增强对酶活产生正面的影响。
　　综合前导肽氨基酸残基的保守性、可能的结构以及亲水性与疏水性分析，将前导肽分成Ⅰ(1-11AA)、Ⅱ(12-31AA)、Ⅲ(32-47)、Ⅳ(48-71AA)共4段。通过前导肽片段缺失研究，发现前导肽的Ⅲ-Ⅳ段是RML前导肽中至关重要的一段，能独立指导完成脂肪酶成熟肽的折叠过程，形成活性构型，在成熟肽折叠过程中Ⅲ、Ⅳ段前导肽共同起作用；而Ⅰ-Ⅱ段对RML酶活性的影响很小，但对RML热稳定性十分关键。将Ⅲ-Ⅳ段再次细分为E、F、G三段，该三段前导肽在发挥分子内分子伴侣的生物学功能时相辅相成，缺一不可。我们推断Ⅲ-Ⅳ上高保守性氨基酸与成熟肽上的氨基酸形成相互作用，指导RML脂肪酶折叠成基本的α/β结构，保证其生物学活性结构的形成，而其他氨基酸则主要起到稳定前导肽自身的结构的作用，并对RML空间结构进行微调；前导肽Ⅰ-Ⅱ段其作用可能与调节RML构型的刚柔性有关。
　　借助动力学模拟技术及分子对接技术建立了前导肽模型、前导肽与成熟肽复合模型以及突变酶的结构模型，获得了RML前导肽的关键氨基酸残基位点，初步明晰了RML前导肽对成熟肽的别构调控机理。前导肽通过疏水作用调控RML分子表面的溶剂可接近性，并结合关键残基与成熟肽的氢键作用调控RML的空间结构，从而改变了脂肪酶的活性和稳定性。成熟肽分子活性口袋区域范围变大、盖子疏水性减弱、活性中心疏水性的增强，活性中心蛋白分子外部偏移，分子柔性的改善都是前导肽引起脂肪酶活性的提高的有利因素；而分子柔性降低，突变酶表面亲水性增强，盖子亲水性增加以及活性中心亲水性减弱则是前导肽引起脂肪酶稳定性提高的有利因素。
　　以前导肽的功能及前导肽对脂肪酶的别构调控机理为指导，可以实现有目的地、快速、高效地改造RML，获得具有更高应用价值的新型突变酶。同时，本文的研究也为其它脂肪酶前导肽的研究以及基于前导肽的改造提供了一定的参考。