【摘 要】
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食源性致病菌的快速、准确、灵敏检测对于保障食品安全具有重要意义。电化学传感器具有响应速度快、操作简单、灵敏度高的优点,已被应用于医疗诊断、重金属检测和药物分析等领域,此外,在致病菌检测方面同样也受到了广泛的研究和关注。然而,由于电化学传感器的识别元件与目标物结合的不可逆性,导致多数电化学传感器在每次检测后均需重新制备电极,电极重新制备引起的重现性、重复性问题常常给电化学传感器的实际应用带来极大障碍
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食源性致病菌的快速、准确、灵敏检测对于保障食品安全具有重要意义。电化学传感器具有响应速度快、操作简单、灵敏度高的优点,已被应用于医疗诊断、重金属检测和药物分析等领域,此外,在致病菌检测方面同样也受到了广泛的研究和关注。然而,由于电化学传感器的识别元件与目标物结合的不可逆性,导致多数电化学传感器在每次检测后均需重新制备电极,电极重新制备引起的重现性、重复性问题常常给电化学传感器的实际应用带来极大障碍。因此,本研究基于锁核酸和仿生粘附蛋白设计了新型可更新电化学生物传感器,以典型食源性致病菌为检测对象,实现在不重新制备电极的情况下快速更换识别元件。研究内容及结果如下:首先,基于锁核酸（Locked Nucleic Acid,LNA）设计了一种用于南美白对虾中沙门氏菌检测的可更新电化学生物传感器。LNA是一种经过特殊修饰的RNA类似物,可与DNA或RNA互补配对,具有突出的亲和力和稳定性。采用电化学沉积法在玻碳电极（Glassy Carbon Electrode,GCE）表面制备多孔金纳米基底以提高电极灵敏度,以巯基修饰的LNA作为中间连接元件将沙门氏菌适配体修饰于电极表面,从而实现沙门氏菌的特异性识别。检测后通过升温使LNA与适配体间的氢键断裂解除配对,从而实现电极表面适配体的脱离与更新。在优化条件下,所制备可更新传感器在6×10~1-6×10~5 CFU/m L的沙门氏菌浓度范围内,沙门氏菌浓度的对数值与电子转移阻抗（Rct）线性相关,线性回归方程为y=523.932+130.216x,相关系数R~2=0.992,检测限（LOD）达到20.704 CFU/m L。该传感器具有良好的重现性,相对标准偏差（RSD）仅为4.085%。其次,基于新型粘附蛋白设计了一种用于南美白对虾中大肠杆菌O157:H7（E.coliO157）检测的可更新电化学生物传感器。由于LNA的分子量相较于细菌的尺寸较小,不利于检测对象在电极表面的捕获与固定。因此,设计了一种新型长链状粘附蛋白作为可更新电化学传感器的中间连接元件。粘附蛋白由3,4-二羟基苯丙氨酸（Dihydroxyphenylalanine,Dopa）构成的粘附段和赖氨酸（K）、谷氨酸（E）交替排列构成的延伸段组成。蛋白黏附段通过Dopa与电极表面的金纳米粒子（Gold Nanoparticles,Au NPs）鳌合,延伸段通过4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（4-（N-Maleimidomethyl）Cyclohexane-1-Carboxylic Acid 3-Sulfo-N-Hydroxysuccinimide Ester Sodium Salt,s SMCC）与巯基修饰的短链核酸（L-DNA）连接,进而将3’端修饰互补核酸短链（C-DNA）的适配体通过L-DNA固定在电极上,用于特异性检测E.coliO157。通过控制温度使互补的核酸短链解链,更换适配体即可得到新的检测E.coliO157的电化学传感器。该可更新的电化学传感器具有操作简单、检测时间段的优点,大肠杆菌检测时间为30 min。优化实验条件下,所构建的传感器在1.5×10~1至1.5×10~5 CFU/m L的大肠杆菌浓度范围内,Rct与E.coliO157浓度的对数呈线性关系,线性方程为y=287.725+310.423x,相关系数R~2=0.995,LOD达到3.719 CFU/m L。应用于南美白对虾中E.coliO157的检测时,回收率96%-107%之间,表明该电化学传感器具备应用于实际样品的检测的潜力。最后,将所设计的可更新电化学传感器与微流控技术相结合,实现了E.coliO157和沙门氏菌的自动化连续检测。以PDMS和PMMA分别制造样品微通道层和盖板,以丝网印刷电极（Screen Printing Electrode,SPCE）制备电化学传感器,建立了微流控电化学检测平台。该传感器在连续检测两种典型食源性致病菌的过程中避免了换能器元件和中间连接元件的重复修饰,缩短了适配体修饰传感器的制备时间。在优化实验条件下,E.coliO157和沙门氏菌浓度的对数值与DPV峰值电流分别在2.410×10~1-2.410×10~5 CFU/m L和2.820×10~1-2.820×10~5 CFU/m L范围内有良好的线性关系,线性方程分别为y=37.117-0.897x和y=39.999-1.200x,相关系数R~2分别为0.994和0.992,E.coliO157和沙门氏菌的检测限分别为6.351CFU/m L和9.203 CFU/m L。
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