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本实验室前期克隆表达了黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1,并利用Modeller多模板建模得到了其三维结构。在此研究基础上,通过理性设计的手段确定突变的氨基酸位点并构建突变体,测定突变体的酶活力、动力学参数、最适温度、温度稳定性、最适pH及pH稳定性;利用圆二色谱、荧光光谱对比分析突变体结构变化情况,并采用分子动力学模拟研究突变体的蛋白质构象、各氨基酸变化及酶与底物结合的情况,解析其催化活性提高的原因。首先,基于α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1与其它六条不同来源的已有性质表征的鼠李糖苷酶进行多序列比对的结果,确定了2个突变位点,共构建了5个突变体。经过筛选,突变体R404S和N578D的相对酶活力明显提高,分别比野生型酶提高了30%和130%。动力学实验表明其米氏常数（Km）值均比野生型低,其催化速率分别提高了6%和16%,MM/PBSA计算结果显示酶分子与底物的自由结合能降低,实验数据和结合能计算结果均说明突变提高了底物和酶的亲和力。圆二色谱及荧光光谱分析可知该两个突变体的结构均与野生型相差不大。分子动力学模拟发现突变体整体构象灵活性提高以及靠近催化“口袋”loop区柔性增强可能是催化活性提高的原因。其次,基于分子对接的设计方法,对α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1与底物pNPR的对接“口袋”进行分析,确定了6个氨基酸位点,共设计了14个突变体。实验证明,A355N、S356Y、D525N三个突变体的相对酶活力明显提高,分别提高了45%、77%和185%。动力学实验表明其米氏常数（Km）值均比野生型低,其催化速率分别提高了4%、9%和53%,MM/PBSA计算结果显示酶分子与底物的自由结合能降低,该变化趋势与实验得到的Km值的变化结果一致。温度稳定性实验证明突变体D525N的热稳定性有所提高,其60oC、65oC、70oC的半衰期分别比野生型提高了0.8 h、2 min、1 min。利用圆二色谱及荧光光谱分析可知该三个突变体的结构均与野生型相差不大。对三个突变体进行分子动力学模拟,发现三者整体蛋白质的波动幅度、（α/α）6桶底loop区域及其内部α螺旋附近的氨基酸区域波动较大,突变位点涉及的氨基酸区域柔性的增强可能是催化活性提高的原因。最后,对多序列比对和分子对接策略得到的五个催化活性提高的单点突变体进行多点联合突变,共得到10个双点突变体。实验证明有6个双点突变体相对酶活性得到明显提高,分别是A355N-R404S、A355N-D525N、A355N-N578D、S356Y-N578D、R404S-D525N、D525N-N578D,分别提高了45%、57%、81%、20%、47%、34%。动力学实验证明米氏常数（Km）值均比野生型降低,MM/PBSA计算结果显示酶分子与底物的自由结合能降低,实验数据和结合能计算结果均说明表明亲和力的提高可能是催化活性增强的主要原因。圆二色谱及荧光光谱分析发现突变体的结构比例均与野生型相差不大。分子动力学模拟分析发现各突变体整体蛋白质构象更灵活,且桶底loop区域的波动幅度较明显,猜测氨基酸的柔性增强提高整体构象的灵活性,加快酶与底物反应提高催化效率。