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虫媒病毒（Arbovirus）是指能在易感的节肢动物如蚊、蜱等体内进行繁殖但不致病,而是通过叮咬的方式将病毒传播给人畜等哺乳动物,从而引起人畜严重疾病的一类病毒。虫媒病毒包括黄病毒科、披膜病毒科、布尼亚病毒科等14个病毒科的540余种病毒,其中,我国已分离到9种,证实在我国流行的病毒有4种,分别为流行性乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、新疆出血热病毒、登革病毒,其中,乙型脑炎病毒和森林脑炎病毒被国家列为法定报告传染源。近年来,随着国际化进程加快,境外虫媒病毒传入我国的可能性显著增加,因此,快速准确的检测虫媒病毒在传染病防控上有重要意义。基因芯片技术是20世纪90年代中期发展起来的一种多学科交叉的新技术,具有高通量、高度平行性、自动化等特点。本研究是以流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）、森林脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus, TBEV）、登革病毒（Dengue virus,DENV）、狂犬病毒（Rabies virus, RV）、西尼罗病毒（West nile virus, WNV）、东方马脑炎病毒（Eastern equine encephalitis virus, EEEV）、西方马脑炎病毒（Western equine encephalitis virus, WEEV）、基肯孔雅病毒（Chikungunya virus, CHIKV）、裂谷热病毒（Rift valley ferver virus, RVFV）、尼帕病毒（Nipah virus, NiV）10种可致人畜脑炎的人兽共患病为研究对象,其中,除RV外,均属于虫媒病毒范畴。本研究旨在制备一种可同时检测JEV、TBEV、DENV、WNV、RV、CHIKV、WEEV、EEEV、RVFV、NiV的寡核苷酸基因芯片,用于对以上10种脑炎病毒进行快速、早期检测。本课题的研究将用于检测10种致脑炎的人兽共患病病毒,对防止外来病原入侵,减少病毒对人类健康和畜牧业发展的危害,有着重要的社会意义和经济价值。本课题首先根据GenBank上登录的JEV、TBEV、DENV、WNV、RV、CHIKV、WEEV、EEEV全基因组序列和所构建的质粒RVFV、NiV的序列,通过DNA Star和DNAman等生物分析软件进行多序列比对分析,选择了高度保守区域设计寡核苷酸探针,每种病毒设计1-2条探针,共设计了18条寡核苷酸检测探针,探针长度约56mer;探针的Tm值为85±3℃;探针与其它病毒基因组的同源性不得大于50%。同时应用Oligo 6.0和Primer premier 5.0引物设计软件,在该保守区域内,针对上述10种病毒共设计了15对特异引物,用于病毒靶核酸的多重PCR扩增。将合成好的探针用50%的DMSO（二甲基亚矾）溶解到终浓度为30μM,经变性处理后,点制到醛基化修饰的玻片上,以制备检测芯片。提取待检病毒RNA进行随机反转录,用15对特异引物经优化组合后共设立四个多重PCR扩增体系: A组合（P3、P9、P10、P12各加1μl）; B组合（P2加2μl,P11、P13各加1μl）; C组合（P4、P15各加2μl,P6、P8各加1μl）; D组合（P1加2μl ;P5、P7、P14各加1μl）。各PCR反应体系均为50μl,aa-dNTPs浓度为20μM,退火温度为52℃,退火时间30s,延伸时间60s。多重PCR反应体系标记aa-dUTP后通过耦联CyTM5荧光染料分子用于芯片进行杂交反应。通过对杂交条件进行优化,最终确定点样探针浓度为30μM,最佳杂交液浓度含有40%甲酰胺,最佳杂交温度为45℃,最佳杂交时间为2h。利用优化后的杂交条件,对基因芯片进行有效性、重复性、特异性、敏感性验证。用上述10种病毒的PCR扩增产物混合后进行芯片杂交,结果表明,在所有病毒探针位点均可以看到明显的检测信号,而阴性对照信号较弱或没有信号,说明该检测方法有效性良好。从三批不同时间制备的芯片中各随机抽取2张,用于验证芯片的稳定性与重复性,杂交结果显示,无论是同一批次之间的芯片还是不同批次之间的芯片,杂交效果理想,稳定性与重复性较好。用黄热病毒（YFV）、口蹄疫病毒（FMDV）、肠道病毒（EV71）、流感病毒（H1N1）进行非特异性验证,结果表明,没有非特异信号产生,说明该检测方法特异性良好。通过对TBEV、JEV、RV最低检测病毒量和最低检测拷贝数进行该方法的敏感性试验,结果表明,对TBEV最低检测病毒量为87 TCID50,对JEV、RV最低检测拷贝数分别为9.05×102、1.13×103。为进一步验证本研究所建立的基因芯片检测技术的实际检测效果,以TBEV、JEV、DENV做为模拟未知病毒,取病毒感染上清与Balb/c小鼠鼠脑混合做为模拟临床标本,按照未知病原进行基因芯片检测。杂交结果显示,该方法可以特异的检测模拟临床标本。本研究建立了一种可检测10种致脑炎病毒的寡核苷酸基因芯片检测方法,可用于诊断10种致脑炎病毒,具有快速、简便、通量高等特点。