第一部分溴及末端结构域蛋白功能抑制对肝细胞性肝癌的影响及机制的研究背景目前,对原发性肝癌特别是原发性肝细胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）治疗的研究进展比较缓慢。近年来,随着对肿瘤靶向治疗包括联合靶向治疗研究的不断深入,其有望成为HCC的治疗新的方向。溴及末端结构域（Bromodomain and extraterminal,BET）蛋白是一类含溴结构域的高度保守的蛋白质,其中溴结构域（Bromodomain,BD）可以与乙酰化的染色质相互结合,对基因的转录有重要的调控作用。BET蛋白抑制剂已经在某些癌症模型的研究中被证实具有良好的肿瘤抑制作用,被认为是潜在治疗癌症的药物选择。前期研究证实,BET蛋白在HCC细胞系中高表达,BET蛋白抑制剂在体外HCC细胞系和异种移植肿瘤模型中具有抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的作用。但是BET蛋白抑制剂在原发性HCC模型中的治疗作用却鲜有报道。实验目的本课题采用水动力转染质粒的方法诱导小鼠原发性HCC模型,验证BET蛋白功能抑制对原发性HCC的治疗作用,并研究其内在机制。探索BET蛋白抑制剂联合其他靶向药物对HCC有效的治疗方案。材料与方法本研究首先在体外验证了BET蛋白抑制剂JQ1对HCC细胞功能的影响。然后采用水动力转染质粒的方法诱导小鼠原发性HCC模型,验证了JQ1对原发性HCC的治疗作用。通过体内和体外实验评估了JQ1对程序性细胞死亡蛋白配体1（Programmed cell death protein ligand 1,PD-L1）表达的调节作用。利用Hep G2细胞验证了JQ1对Rab GTP蛋白家族相关蛋白表达的影响。在Hep G2细胞系中,对Rab8A分别进行过表达和沉默表达,验证Rab8A在调节PD-L1表达中发挥的关键作用。本课题进一步评估了JQ1联合PD-L1抗体的治疗策略在小鼠原发性HCC模型中的治疗效果,并且分析这种联合治疗抗肿瘤作用的免疫机制。结果通过体外实验证实,HCC细胞经过JQ1处理后,其增殖、迁移和侵袭能力明显受到抑制。在水动力转染质粒的方法诱导的小鼠原发性HCC模型中,JQ1单药治疗不能有效的抑制原发性HCC的肿瘤进展。通过对其机制进行研究发现,无论是体内还是体外实验,JQ1处理虽然没有影响HCC细胞内PD-L1总的表达水平,但是上调了PD-L1在HCC细胞膜上的表达量。由于Rab GTP蛋白家族是细胞内膜蛋白通过囊泡转运的重要调节因子,我们发现HCC细胞经过JQ1处理后增强了Rab8A的表达水平。通过免疫荧光实验证实,Rab8A对PD-L1在细胞膜上的表达起了重要的调节作用。由此揭示了BET蛋白抑制剂通过增强HCC细胞中Rab8A的表达,进而上调了PD-L1在细胞膜上的表达量的机制。我们进一步证实了,JQ1联合PD-L1抗体的治疗策略能有效抑制原发性HCC的肿瘤进展,明显延长原发性HCC小鼠的生存时间。通过对其机制进行研究发现,联合治疗组小鼠肝脏中CD8阳性T细胞浸润数量明显增多,同时CD8阳性T细胞的激活以及细胞毒性因子的释放也得到了显著增强,从而产生明显的抗肿瘤效果。结论本课题揭示了在小鼠原发性HCC模型中,BET蛋白抑制剂单药治疗不能有效抑制肿瘤进展。机制研究发现,在HCC细胞中BET蛋白抑制剂通过增强Rab8A的表达,进而上调了PD-L1在细胞膜上的表达量。由此,我们验证了BET蛋白抑制剂联合PD-L1抗体的治疗策略能有效提高抗肿瘤免疫反应,明显抑制了原发性HCC的肿瘤进展,为HCC提供有效的治疗方案。第二部分溴及末端结构域蛋白功能抑制对肝脏再生的影响及机制的研究背景肝脏再生是临床中通过外科手段治疗各种肝脏疾病,例如因肝脏各种良、恶性肿瘤行肝部分切除、肝外伤及肝移植能否成功的关键因素。目前,控制肝脏再生的生物学机制仍然不清楚。越来越多的研究表明,各种生长因子、细胞因子和代谢相关的信号通路共同调控了肝脏再生过程。BET蛋白作为控制转录过程中的关键因子调控了某些基因的表达,前期的研究证实,BET蛋白在肝脏相关疾病,例如原发性肝癌、肝纤维化等疾病的发生和进展过程中起到了重要的作用,是治疗肝脏相关疾病的新的靶点。尽管BET蛋白抑制剂对肝癌以及肝纤维化的治疗作用已经有了较多的研究阐述,但是其对肝脏再生过程的影响及其作用机制的研究,鲜有报道。实验目的本课题研究BET蛋白功能抑制对肝脏再生过程的影响,并探索其内在作用机制。材料与方法本课题通过小鼠70%肝部分切除术（Partial Hepatectomy,PHx）模型研究了BET蛋白抑制剂JQ1对肝脏再生过程的影响。进而,分别从体内和体外实验评估了JQ1对肝细胞中yes相关蛋白（Yes-Associated Protein,YAP）/具有PDZ结合基序的转录共刺激因子（Transcriptional Co-Activator with PDZ-Binding Motif,TAZ）和Notch信号通路的调控作用。通过在小鼠正常肝细胞系（AML12细胞系）中对Yap基因过表达或表达沉默,验证了YAP/TAZ和Notch信号通路的串联调控关系。在体内通过特异性的抑制YAP/TAZ信号通路来验证了其对肝脏再生的影响和对Notch信号通路的调控作用。最后,通过腺病毒相关病毒（Adenovirus associated virus,AAV）感染的方式在小鼠肝脏中对Yap基因进行过表达,验证了是否可以挽救由于BET蛋白功能抑制导致的肝脏再生的损伤以及对Notch信号通路的影响。结果本课题通过小鼠70%PHx模型证实了在肝脏再生早期阶段JQ1对肝脏再生产生了明显的抑制作用。机制研究发现,无论在肝脏再生过程中的小鼠原代肝细胞中还是在AML12细胞系中,JQ1治疗均可以抑制YAP/TAZ和Notch信号通路相关蛋白的表达。另外,在AML12细胞系中,通过沉默Yap的表达,导致了Notch1和NICD表达的下调;而Yap过表达后,导致了Notch1和NICD的表达上调。通过在小鼠体内使用维替泊芬特异性的抑制YAP/TAZ信号通路的活性,证实了其对肝脏再生过程的明显抑制作用,同时抑制了Notch信号通路相关蛋白的表达。由此揭示了在肝脏再生过程中YAP/TAZ信号通路和Notch信号通路串联的调控关系。最后我们通过AAV感染的方式在小鼠肝脏中特异性的过表达Yap,证实了过表达Yap可以挽救JQ1对肝脏再生的损伤以及对Notch信号通路的抑制作用。结论本课题揭示了BET蛋白功能抑制能明显抑制肝脏再生过程。在机制上,BET蛋白抑制剂通过YAP/TAZ–Notch1–NICD信号轴对肝脏再生过程起到了关键的调控作用。由于BET蛋白抑制剂在肝再生中的抑制作用,在肝脏相关疾的病治疗过程中应注意使用方法,谨慎使用。