第一部分 缺血预处理对缺血再灌注硬化肝脏p-选择素表达的影响 及保护作用的实验研究 “缺血预处理”（Ischemic Preconditioning, IPC）是指组织多次短暂的缺血后，能增加对随后较长时程的缺血再灌注（Ischemia Rerperfusion, I/R）的耐受力。这一现象15年前在心肌中第一次得到证实，随后得到不断地深入研究。尽管具体机制还不十分清楚，但已被证实有效的激发物有：一氧化氮（Nitrogenmonoxide, NO）、腺苷、前列腺素、缓激肽等等，它们的作用大小随所研究的脏器不同而不同。心脏IPC研究中发现，腺苷与蛋白激酶C（Protein Kinase C, PKC）在IPC中起着关键的作用，IPC能促进腺苷与腺苷受体Al结合后与百日咳毒素敏感的G蛋白偶联，激活磷脂酶C（Phospholipase C, PLC），催化磷脂酰肌醇分解，产生甘油二酯（Diacylglycerol DG），最后激活PKC，使K~+离子通道开放，产生心肌的保护作用。而对肝脏的研究发现，腺苷只能通过NO启动IPC保护肝脏机制，而且它通过抑制白细胞-内皮细胞的相互作用，减少白细胞黏附、聚集、浸润，从而减轻肝脏I/R损伤。 I/R激发炎症介质的释放，使选择素、内皮细胞黏附分子表达上调，介导中性粒细胞滚动、黏附以及血小板-内皮细胞黏附，进而使微血管郁积、阻塞和血栓形成，加重组织缺血缺氧；中性粒细胞浸润，产生大量氧自由基，释放蛋白酶进一步损害组织。实验表明，P-选择素（P-selectin）是介导中性粒细胞滚动和起始黏附的关键介质，在P-选择素缺乏的大鼠中肝脏缺血再灌注后不会出现多形核细胞（Polymorphonuclear cell, PMN）滚动和黏附，同时也发现运用p-选择素单抗后PMN滚动和黏附受到抑制。再者P-选择素介导的PMN滚动和黏附将进一步引起牢固黏附和PMN浸润、迁移，加重肝组织损伤破坏。 因此，我们推测肝脏IPC可能通过促进NO分泌，抑制P-选择素表达，而发 浙江大学硕士研究生毕业论文挥作用的。类似的研究目前尚未见报道。本研究旨在大鼠肝硬化模型基础上，探讨IPC对肝硬化肝脏I爪损伤的保护作用和机制以及IPC对卜选择素表达的影响和作用。 材料和方法1．肝硬化模型复制：雄性SD大鼠，体重200士30克，皮下注射60％四氯化碳橄榔 油剂（0．3。1／100克体重），每4天一次，同时5％乙醇液作唯一饮用水，模型制 备时间60天。2．手术操作：首先游离肝周韧带，于胆总管置管作胆汁5；流并计胆汁分泌量。阻 断左、中叶肝蒂致左、中叶缺血，保持肝右叶和尾状叶血流通畅。按实验设计 的时间要求阻断和开放左、中叶肝蒂，开放左、中叶肝蒂的同时结扎其他肝蒂。3．分组：雄性，肝硬化SD大鼠，40只，随机分为五组，每组人只：假手术组帕 印er。t儿n gr。W，SO组）；缺血再灌注组（Isch。l。－Reperhsl。ngr。W，IR 组）；缺血预处理组（Isch。访Pre。。ndlt。。mug groop，IPC组）；精氨酸预处 理组（L－虹gkec。ndltl。mug gr。W，APC组）；NO－硝基－L－精氨酸甲酯预处 理组预处理组（L－NAME Precondlt。oning grollp，NPc组）。4．指标的检测；以肝组织ATP、ADP、AM：P及EC（用高效液相色谱法测定），血清 ALT、AST、LDH（用全自动生化仪测定）和肝脏胆汁分泌量来评价肝功能。用SP 法免疫组化染色检测肝组织卜选择素蛋白表达，计算肝组织中中性粒细胞浸润 数，并观察形态学变化。 结 果1．缺血30分钟末，IR组、IPC组、APC组、NPC组间ATP含量及能荷水平明显下 降（HO．05）。再灌注120分钟后，IPC组和讪C组ATP含量和能荷水平明显高 于 IR组，而 NPC组与 IR组间无显著差异（HO．05）。2．IR组中，ALT、AST、LDH明显高于 SO组。10 W缺血 5分钟再灌注预处理后（IPC 组），ALT、AST。LDH升高受到明显抑制（HO．000）。予外源性NO一L－Arg预处 理后（APC组）出现上述 IPC样保护作用，而予卜NAME预处理后（NPC组）IPC 保护作用受到抑制。3．IPC组中肝组织胆汁分泌量明显多于IR组（0．101士0．027对0．066土0．027 ml／g 2 浙江大学硕士研究生毕业论文 h、r，HO．002），APC组与IR组及NPC组与SO组间有显著性差异（分另HO．001， HO．000），而 NPC组与 IR组间无显著差异性（HO．05）。4．肝组织中白细胞记数显示：IR组与SO组间有显著性差异（P＜0．001），IPC组 中白细胞浸润受到抑制（HO．028）。予卜缸刀预处理后（APC组）出现同IPC 样作用，而NO合成抑制后（NPC组）IPC保护作用消失。5．IR组肝细胞卜选择素蛋白表达显著增强（HO．of）。IPC组和 APC组卜选择素 蛋白表达明显抑制，而NO合成抑制后仰PC组），P－选择素表达恢复增强 （AO．01）。6．经SPea。等级相关陛分析发现肝组织中卜选择索蛋白表达与中性粒细胞浸 润数之间呈显著性正?