小型模式生物如秀丽隐杆线虫、果蝇和斑马鱼是常用于研究遗传学、神经科学和疾病发展的理想模式生物。通过研究模式生物人们可以从细胞、组织、器官和系统层面全面解析生物系统。由于在物种进化上的保守性,这些模式生物与高等生物有相似的基因结构和功能,常用于遗传学、发育生物学和神经科学等研究领域。无标记光学显微镜如被生命科学工作者大量使用的体式显微镜,目前只能对小型模式生物进行宏观分析。要想对其进行细胞或者亚细胞级别的分析,基于荧光的共聚焦显微镜是更为理想的成像工具。然而,由于图像采集时间过长和长时间的激光照明,产生的光毒性和光损伤也会导致小动物生理机能的损伤甚至样本死亡。无标记的拉曼显微技术也被应用于分析小型模式生物体内的特定亚细胞结构如脂滴,同样受限于速度,无法满足快速、高通量检测的要求。能够应用于线虫体内亚细胞级别结构分析的宽场无标记光学显微成像技术还有待进一步探索。暗场显微镜由于其图像形成主要来源于样品信号的贡献,因此具有出色的对比度,也被广泛应用于纳米颗粒和薄细胞样品的检测中,但是其对厚样品成像的应用却很少见。本文将探索暗场显微镜是否能够实现小型模式生物秀丽隐杆线虫体内亚细胞结构的可视化,并探索该技术在线虫体内脂肪水平分析中的应用。本文围绕如何提高暗场显微系统的光学切片性能,以及如何抑制扩展光源带来的相干伪影,提供线虫体内密集分布脂滴的直接可视化并结合图像分析方法对单个脂滴进行形态分析。具体研究内容如下:1.本文通过数值模拟对比了采用透射式和反射式照明的暗场显微成像系统对其光切性能和图像对比度的影响。对于薄样品而言,反射式照明情况下图像对比度略高于透射式照明的情况;然而对于厚样品,反射式照明情况下图像对比度远高于透射式照明的情况,受离焦信号的干扰也更小。根据理论模拟结果,搭建了反射式照明的暗场显微成像系统,利用微球测得成像系统的侧向和轴向分辨率分别为260nm和520nm。并在线虫体内实现了亚细胞级别的分辨率,成功解析了生殖细胞细胞核与核仁、肠道细胞及其内部的脂滴等结构。综上,本文通过理论模拟和实验结果证明了反射式照明的暗场显微镜在对厚样品如秀丽隐杆线虫成像上有着巨大潜力。2.本文研究了暗场显微镜中散射光的干涉对成像线性的影响,基于数值模拟研究了暗场显微镜中照明孔径角对散射光之间干涉的影响并通过实验结果进行验证。由于使用扩展光源,相干长度内的散射光之间必然存在相干性,而干涉是否改变样品信号原本强度分布则取决于照明数值孔径角。仿真结果表明,照明孔径相对于探测孔径而言很小时,不同散射光之间的干涉会改变样品原本的强度分布;而随着照明数值孔径增大,散射光之间的光程差随之增大,它们之间的干涉就不再改变样品的强度分布,成像过程恢复线性。然而增大照明数值孔径意味着光在样品中经过的路径变长所以对比度也会下降,因此需要在分辨率、对比度和线性度之间进行权衡来选择照明数值孔径。通过使用暗场成像通道对多层标准微球成像,并使用荧光图像作为非相干成像的参照标准,证明在样品空间的相干长度内散射光之间的干涉并不会改变相邻小球之间的强度分布,这对于秀丽隐杆线虫体内的密集脂滴的成像与后续应用至关重要。3.反射式暗场显微镜可以解析线虫肠道内的大部分脂滴,但是其致密的分布导致多重散射和离焦信号更强使得图像对比度下降。因此,本文加入非对称照明光源来降低离焦信号的影响,并在脂滴堆积区域验证了其更好的图像对比度。然后结合基于U-net结构的卷积神经网络,利用非荧光标记的图像实现了线虫体内单个脂滴的分割,网络对于差分相衬数据中脂滴的预测准确率为85%。分割结果可以应用于任意生理状态和任意菌株的线虫,通过其体内脂滴的数量和尺寸来进行脂肪水平的分析。