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珊瑚为许多海洋生物提供了栖息地。虽然珊瑚所在的地方通常为寡营养盐海域,但珊瑚礁具有很高的初级生产力,其固定的有机物能够供给大量的珊瑚礁生物,形成的珊瑚礁系统兼具商业功能和休闲渔业功能。珊瑚依赖于珊瑚动物本身和虫黄藻之间的共生关系,而这种共生关系是建立在彼此相互提供营养的基础上的,珊瑚为虫黄藻提供栖息场所和无机营养盐,而虫黄藻为珊瑚提供光合作用产物。然而这种珊瑚虫黄藻共生系统极易受到温度、营养盐、盐度和光照等环境因素的影响。热胁迫能够引发光抑制、氧化损伤并最终导致这种共生关系的破裂,珊瑚白化就会因此发生。这个不利的过程通常被认为是由于虫黄藻受到外界胁迫而产生过量的活性氧（reactive oxygen species,ROS）对宿主细胞造成有害的影响,因此活性氧可能在细胞死亡和珊瑚白化过程扮演着重要的角色。然而,关于虫黄藻在正常条件和胁迫条件下活性氧的动力学及其分子机制的研究还很有限。本实验中以虫黄藻Fugacium kawagutii和Effrenium voratum作为研究对象,通过检测其生理参数以及运用分子生物学手段,探究高温及氮限制和磷限制对其生理状态（生长曲线、光合效率、叶绿素a含量、细胞大小、DIP浓度）,ROS的产生及其相关酶NADPHoxidase（NOX）的基因表达所产生的影响。表达水平稳定的内参基因是准确定量目的基因的表达水平所需要的,但有些常见内参基因,如18S核糖体RNA（18S rRNA）,甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gapdh）等内参基因在不同细胞类型和不同处理条件下是不稳定的,因此挑选在不同处理条件下稳定表达的内参基因是必要的。在本研究中,我们从11个候选内参基因中筛选出F.kawagutii在不同培养条件下最适的内参基因,这11个基因分别为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）、S-腺苷甲硫氨酸合成酶（s-adenosyl-L-methionine synthetase,SAM）、细胞色素氧化酶亚基 1（cytochrome oxidase subunit 1,Cox）、钙调蛋白（calmodulin,Cal）、核糖体蛋白（ribosomal protein S4,Rp-s4）、肌动蛋白（actin,Act）、亲环蛋白（cyclophin,Cyc）、微管蛋白（beta-Tublin,Tub）、热休克蛋白（heatshockprotein90,Hsp）、泛素蛋白（ubiquitin,Ubiq）和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）。主要的研究方法和结果如下:1.在高温处理组中,设置高温组的培养温度为32℃,对照组的培养温度为25℃,其余培养条件保持一致,比较其在两种不同条件下的细胞生长曲线、光合效率、ROS的产量,以及控制ROS形成的基因NOX的表达水平。结果显示,共生虫黄藻F.kawagutii在热激96小时后,高温组的细胞量显著低于对照组,但存活细胞的光合效率有所提高;热激2小时后高温组的ROS含量显著高于对照组,但在24小时后ROS含量开始下降至正常水平;在72小时和96小时后显著低于对照组,而NOX基因在热激2小时、24小时和96小时这三个时间点都是下调表达。非共生虫黄藻E.voratum在热激后24小时细胞尚能维持生长,其后生长减缓;ROS始终显著低于正常组。此外还发现ROS的产量在暗周期结束进入光周期2小时后达到最高,然后降低并维持在较低水平。上述结果表明,高温使F.kawagutii生长速度减慢,但不抑制其生长。短时间的热激会导致ROS的增加,但在一定时间后,F.kawagutii可能能够适应高温,并调节ROS至正常水平,表明F.kawagutii能够对热胁迫产生适应性;同时也表明了光照周期能够影响ROS的产生。2.在氮限制对F.kawagutii的ROS水平和NOX表达量影响的探究中,我们测定了F.kawagutii细胞的生长,光合效率,细胞大小,细胞内ROS水平和NOX基因的表达情况。研究表明,在氮限制条件下,F.kawagutii细胞生长变缓,细胞显著增大,而光合效率未有显著变化,细胞内的ROS水平也显著增加,但NOX基因无显著上调。该实验结果与相关研究结果一致,氮限制条件下细胞会继续光合固碳并生长,使得细胞增大;氮限制使得抗氧化酶活性降低或非NOX产生ROS机制上调,导致细胞内ROS的积累。3.在磷限制对F.kawagutii的ROS水平和NOX表达量影响的探究中,我们测定了 F.kawagutii细胞的生长、光合效率、培养基中DIP浓度、细胞内ROS 水平和NOX基因的的表达情况。研究表明,磷限制组的培养基中DIP一直处于接近0的水平,细胞的生长也变缓,这些生理参数都表明细胞处于磷限制状态。细胞内的ROS及NOX基因表达水平均出现下调趋势,但二者皆不显著。我们推测磷限制对F.kawagutii ROS的产生无明显影响,或者是F.kawagutii产生了磷限制的适应机制,使得细胞内的ROS无显著变化。4.本研究在以往研究的基础上,挑选了 11个常见的内参基因作为候选基因,这11个内参基因分别是利用GeNorm和NormFinder两个内参基因分析软件计算出每个内参基因在不同条件下的稳定性,综合这两个软件的分析结果筛选出较为稳定的内参基因。结果表明GAPDH和PCNA是所有条件下最为稳定的内参基因。本研究结果有助于今后研究不同生长条件对F.kawagutii基因表达的影响。