ε-聚赖氨酸高产菌选育及其发酵优化

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ε-聚赖氨酸是目前天然防腐剂中具有优良防腐性能和巨大商业潜能的微生物类食品防腐剂,在80年代日本首先发现由微生物发酵产生。ε-聚赖氨酸主要由白色链霉菌(Streptomyces albulus)产生,是由人体必需氨基酸L-赖氨酸构成的多肽,一般有25-30个赖氨酸残基通过其α-羧基和ε-羧基形成的酰胺键联接而成。目前在国内ε-聚赖氨酸的生产还处于实验室研究阶段,而日本早已实现工业化生产,因此,开展ε-聚赖氨酸的研究具有重要的意义。本研究采用紫外诱变和硫酸二乙酯(DES)化学诱变对一株产ε-聚赖氨酸白色链霉菌(Streptomyces albulus)进行复合诱变处理,处理液接种于甘氨酸和多聚赖氨酸抗性平板选育。首先优化了甘氨酸和ε-聚赖氨酸剂量、紫外照射剂量和化学诱变剂DES剂量等诱变条件,得到抗性平板中甘氨酸和ε-聚赖氨酸的临界浓度分别为7 mg/mL和0.30 mg/mL;通过研究该菌株的紫外诱变致死率曲线和DES诱变致死率曲线,根据遗传育种经验,确定45 s为最佳紫外诱变剂量、0.4%为最佳DES诱变浓度。诱变后的菌株经初筛和复筛,最后得到一株较高产ε-多聚赖氨酸的菌株Streptomyces albulus DES-2,其ε-聚赖氨酸发酵产量达到0.73 g/L,是出发菌株的2.2倍。经5次传代发酵表明该菌株稳定。研究了发酵过程中不同碳源和氮源对Streptomyces albulus DES-2菌株ε-聚赖氨酸产量的影响。单因素试验结果表明,葡萄糖是最佳碳源;无机氮有助于产物的合成,有机氮能促进菌体生长;复合氮源比单氮源的发酵效果好,在所有复合氮源中,以(NH4)2SO4与酵母粉复配组合最好,不但在合成菌体方面起了很大作用,而且促进了产物的生成。通过Plackett-Burman实验对发酵培养基中八种成分进行了筛选,包括葡萄糖、酵母粉,硫酸铵、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O等,发现葡萄糖、硫酸铵、酵母提取物三个因素在发酵过程中影响显著。利用最陡爬坡实验确定Box-Behnken试验设计的中心点,对影响ε-聚赖氨酸产量的显著影响因素葡萄糖、硫酸铵、酵母提取物进行了三因素三水平Box-Behnken试验,通过RSM分析得出了优化模型: Y=1.69633 +0.064125 X1+0.025375X2 -0.12125X3 -0.06525 X1 X3 -0.07875 X2 X3-0.10367 X12-0.058667 X22-0.111542 X32,模型的极值点为X1(葡萄糖)=0.629,X2(酵母粉)=0.907,X3(硫酸铵)=-1.048.优化后的培养基组成为(g/L):葡萄糖28.145、酵母粉8.907,硫酸铵6.904、K2HPO4 1.5、KH2PO4 1.5、MgSO4·7H2O 0.3、ZnSO4·7H2O 0.04、FeSO4·7H2O 0.04。优化后ε-聚赖氨酸得率Y(ε-PL)预测最大值为1.792 g/L,验证实验结果为1.78 g/L.
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