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荔枝核作为常用的中草药之一,主要用于治疗与肝脏相关的疾患。其化学成分包括皂苷、蒜质和脂肪酸等多种物质。研究发现,荔枝核黄酮类提取物对HepG2.2.15细胞培养上清液中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg),乙型肝炎e抗原(HBeAg)以及细胞外HBV DNA有明显的抑制作用;那么作为荔枝核主要化学成分之一的皂苷,是否同样具有抗HBV的作用,目前尚未见文献报道。转基因HepG2.2.15细胞株载有HBV全基因组,能够进行病毒复制并稳定分泌感染性病毒颗粒及HBsAg和HBeAg,因此被广泛用于抗病毒药物的筛选和疗效评价。我们以HepG2.2.15细胞作为靶细胞,采用MTT比色法观察不同浓度荔枝核总皂苷对细胞的毒性作用;并分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光定量聚合酶链式反应(PCR)的方法测定细胞培养上清中HBsAg,HBeAg及细胞外HBV DNA的含量,以此评价荔枝核总皂苷体外抗HBV的作用。现报告如下:实验一: HepG2.2.15细胞株培养体系的建立目的使HepG2.2.15细胞正常生长,为其后荔枝核总皂苷的药物干预实验做准备。方法分为细胞复苏、细胞培养、细胞传代、细胞冻存四个步骤。结果细胞复苏后三周内生长速度较缓慢,但传代后生长状态良好,可用于药物干预实验。实验二:细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg分泌曲线的绘制目的观察HepG2.2.15细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的分泌情况。方法HepG2.2.15细胞经传代培养,在其贴壁后1～6d分别收集细胞培养上清液,-20℃保存,统一检测。使用ELISA法检测细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg,显色反应后,酶标仪读取A450nm值,绘制分泌曲线。结果HepG2.2.15细胞在贴壁后1～6d,其培养上清液中的HBsAg和HBeAg通过酶标仪所测的A450nm值逐渐增大,分泌曲线呈现逐渐上升趋势。实验三:药物对细胞的毒性实验目的观察不同浓度荔枝核总皂苷对HepG2.2.15细胞的毒性作用。方法荔枝核总皂苷配制成0.8,0.4,0.2,0.1,0.05,0.025,0.0125,0.00625g/L共8个浓度梯度,拉米夫定配制成0.25g/L;HepG 2.2.15细胞以1×107个/L接种于96孔培养板,细胞贴壁后各药物浓度组换入相应浓度含药培养液,阴性对照组换入正常培养液。于加药d6吸去上清液,每孔加5g/L MTT 20μL,37℃孵育4h,弃上清液后每孔加入DMSO 150μL,震荡10min,测A490nm值;通过公式计算细胞抑制率和半数中毒浓度(TC50)。结果荔枝核总皂苷的0.8,0.4,0.2,0.1,0.05,0.025,0.0125,0.00625g/L组对细胞的抑制率分别为53.7%,39.3%,26.1%,12.7%,11.1%,8.2%,6.1%,4.2%,荔枝核总皂苷的TC50为0.67g/L;0.25g/L拉米夫定组对细胞的抑制率为43.4%。在此实验中,0.025g/L荔枝核总皂苷组对细胞的抑制与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05);0.4g/L荔枝核总皂苷组和0.25g/L拉米夫定组在细胞毒性上差异无统计学意义(P>0.05)。实验四:细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的测定目的观察不同浓度荔枝核总皂苷对HepG2.2.15细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的影响。方法使用ELISA法检测细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg,显色反应后,酶标仪读取A450nm值;通过公式计算抗原抑制率和50%药物抑制浓度(IC50)。结果荔枝核总皂苷各浓度实验组相对于阴性对照组,其所测A450nm值均降低,且随着药物浓度的增加,培养时间的延长,降低愈明显。0.025g/L荔枝核总皂苷组在d6细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg与阴性对照组差异有显著统计学意义(P<0.01),而其他浓度组在d3,d6两个时间段细胞培养上清中HBsAg和HBeAg分泌量均和阴性对照组差异有显著统计学意义(P<0.01)。在d6,荔枝核总皂苷对细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的IC50分别为0.096g/L和0.085g/L。实验五:细胞培养上清液中HBV DNA的测定目的观察不同浓度荔枝核总皂苷对HepG2.2.15细胞培养上清液中HBV DNA的影响。方法按照Taqman HBV核酸扩增荧光检测试剂盒说明书操作。引物序列为P1:5’ATC CTG CTG CTA TGC CTC ATC TT 3’; P2:5’ACA GTG GGG GAA AGC CCT ACG AA 3’;荧光探针序列为:5’GGC TAG TTT ACT AGT GCC ATT TG 3’。反应结束后由计算机自动分析出HBV DNA定量结果,计算HBV DNA抑制率和50%药物抑制浓度(IC50)。结果荔枝核总皂苷各浓度实验组相对于阴性对照组,所测拷贝量均降低,且随着药物浓度的增加,培养时间的延长,降低愈明显。0.025g/L荔枝核总皂苷组在d6细胞培养上清液中的HBV DNA含量与阴性对照组差异有显著统计学意义(P<0.01),而其他浓度组在d3,d6两个时间段细胞培养上清中HBV DNA的含量均和阴性对照组差异有显著统计学意义(P<0.01)。在d6,荔枝核总皂苷对细胞培养上清液中HBV DNA的IC50为0.128g/L。结论:1、HepG2.2.15细胞能向培养上清液中稳定地分泌HBsAg和HBeAg,其分泌量随着细胞培养时间的延长而逐渐增加。2、荔枝核总皂苷对HepG2.2.15细胞的毒性较小,TC50为0.67g/L,但随着药物浓度的提高,其毒性作用逐渐增加。3、荔枝核总皂苷的不同浓度对HepG2.2.15细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的分泌均有一定的抑制作用,且随药物浓度的增加、作用时间的延长,抑制也随之增强。4、荔枝核总皂苷的不同浓度均能有效降低HepG2.2.15细胞培养上清液中的HBV DNA含量,且随药物浓度的增加、作用时间的延长,其作用效果越明显。5、荔枝核总皂苷在体外具有抗HBV的作用;而且从治疗指数来看,属于有效低毒药物。