研究目的:皮肤损伤是临床上的常见病与多发病。常见的皮肤损伤有烧伤、咬伤、日晒伤、碰伤、冻伤、刀割伤、电灼伤等。仅限于表皮的损伤为轻度,真皮及皮下组织损伤、断裂为中度,肌肉、肌键、骨头乃至神经的损伤则为重度。皮肤损伤愈合不良可形成瘢痕,这不仅影响患者美观,还可导致患者肢体的功能障碍,甚至危及生命。如何促进损伤皮肤的结构功能完整是临床工作的重点问题。基于干细胞治疗皮肤损伤的技术被誉为最有前景性的治疗之一。干细胞具有多向分化潜能和低免疫性,可利于慢性创伤和急性创伤的治疗。毛囊干细胞(Hair Follicle stem cells,HFSCs)来源于皮肤毛囊隆突部,在生理情况下可参与毛发与毛囊的周期性生长;在病理情况下时,HFSCs脱离静息状态,呈线性方式向伤口中心迁移,并增殖分化为上皮细胞、毛囊、皮脂腺等,修复损伤的表皮。如何高效地促进HFSCs的增殖分化对皮肤的组织修复具有重要的意义。实验证明,Wnt/β-catenin信号通路不仅在胚胎发育过程中促进表皮及毛囊的形成,出生以后可维持成体组织干细胞的自我更新和分化。若能有效地刺激该条通路,则可有利于皮肤的修复。中药治疗皮肤创伤历史悠久,明清时期达到鼎盛,相关论著很多,并衍生了不同的学术流派。龟板散是用治皮肤溃疡的有效方剂,其君药龟板性甘、寒,归肾、肝、心经,具有滋阴潜阳,益肾健骨的功效。在前期研究中,本课题组发现龟板提取物能调控骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)Wnt的表达、促进表皮干细胞增殖、对紫外线及无血清损伤引起的表皮干细胞的凋亡有修复作用。HFSCs与表皮干细胞具有同源性,故推测,龟板提取物亦可以通过Wnt/β-catenin信号通路促进HFSCs的增殖或分化,从而达到改善伤口愈合的目的。本研究旨在通过将S8、S9分别作用于大鼠创伤部皮肤及HFSCs,以研究S8、S9是否能通过Wnt/β-catenin信号通路促进HFSCs修复创面。研究方法:1、200～220 gSD雄性大鼠,制作触须部皮肤创伤模型,根据治疗方案的不同,将SD大鼠分为空白对照组(生理盐水处理)、模型组(含10%DMSO的生理盐水处理)、阳性对照组(表皮生长因子,Epidermal growth factor,EGF处理)、实验组(分别用龟板提取物十四酸甾醇酯(S8)与四-甾酮(S9)),观察各组大鼠创面愈合情况,根据评分标准对各组创面修复进行评分,计算创面愈合率并统计学分析,病理切片观察皮肤创面修复情况,免疫荧光检测S8、S9对大鼠皮肤创口修复过程中Wnt/β-catenin信号的影响。2、择1～3d SD乳鼠,取触须部毛囊,采用两步酶消化法体外分离培养HFSCs。免疫荧光法检测培养的HFSCs的细胞表面标记物CD34与CD71的表达。购买龟板提取物标准品S8、S9分别作用于体外培养的HFSCs,采用2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐(CCK-8),探究不同药物浓度作用下,HFSCs的细胞活性;免疫荧光、Western-blot、实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)技术检测 S8、S9 干预下的 HFSCs 胞质内β-连环蛋白(β-catenin)、糖原合成激酶(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)蛋白、淋巴增强因子 1(lymphoid enhancer factor,Lefl)、核内转录因子 3(transcription factor 3,Tcf3)、c-myc、cyclin D1 基因的表达情况。3、择200～220 gSD雄性大鼠,制作触须部创伤模型之后,将造模成功的大鼠按随机分配原则分为空白对照组、模型组、实验组。按照组别的不同,空白对照组SD大鼠两侧创面上侧及前侧创缘中点分别皮下注射10 μLPBS;模型组按同样的方法注入用普通KSF-M培养基培养的用PBS重悬的密度为106个/mL的HFSCs 10 μL;实验组每个注射位点注入用含30 μg/mL S9的KSF-M培养基刺激24 h的等量HFSCs的PBS混悬液10μL,正常饮食饲养4 d,通过HE染色检测各组创面修复情况,VG染色检测各组胶原蛋白改变。研究结果1、半定量统计结果显示术后4d及7d,S8组与S9组大鼠平均得分及愈合率均高于空白对照组及模型组。病理学结果显示,术后1d各组大鼠创面炎性反应明显,以中性粒细胞浸润为主。术后4 d,空白对照组及模型组充血及炎性细胞浸润明显,部分有血痂覆盖,表皮与真皮结合不牢,无活动性出血;S8组、S9组及阳性对照组表皮覆盖完整、充血不明显,表皮与真皮结合相对牢固,无活动性出血。术后7d,各组SD大鼠创面炎性反应完全消退,空白对照组及模型组大鼠皮肤增厚明显,尤以棘层皮肤增厚为最甚;S8组及S9组表皮亦有轻微增厚的现象。以上表明S8及S9在创口愈合早期及中期能抑制减轻炎症反应、创面出血、促进创面结痂,对促进创面的愈合起着积极性的作用。S8、S9作用于SD大鼠触须部后,免疫荧光检测组织中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白,较空白对照组β-catenin表达升高、GSK-3β表达下降、Lef1表达升高、c-myc表达无明显改变、cyclinD1表达升高、S8作用下Tcf3表达上升,S9表达下降,证实S8、S9可以通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进大鼠触须部创面愈合。2、用“两步酶法”分离的细胞为贴壁细胞,形态较小,胞体透亮,体外分离培养的细胞贴壁生长,细胞形态较小,胞体透亮,细胞与细胞之间紧密排列且折光性强,鹅卵石外观,呈CD34、CD71阳性。CCK-8检测显示,S8及S9作用于HFSCs后均明显促进HFSCs增殖,且以30μg/mL组为最佳。S8、S9作用于HFSCs后GSK-3β表达下降,β-catenin、Lef1、c-myc、cyclin D1 表达升高,表明 S8、S9 能激活HFSCs中Wnt/β-catenin通路。但S8作用下Tcf3表达上升,S9作用下Tcf3表达下降,提示还可能有其他通路影响Tcf3表达。3、S9诱导的HFSCs修复大鼠触须部创面的实验结果显示:术后4 d,HE染色结果显示空白对照组充血及炎性反应明显,表皮与真皮连接不牢;模型组大鼠充血现象明显,表皮与真皮连接牢固;S9组大鼠创面皮肤部分区域有轻微充血,未见明显炎症反应,表皮与真皮连接牢固,修复较模型组好。VG染色显示,各组创面靠近正常皮肤创口边缘处胶原纤维最多,创面中心胶原纤维减少。其中空白对照组表皮与真皮连接不牢,创面中心几乎无胶原纤维填充;造模组创面中心有少量胶原纤维填充;S9组胶原纤维含量最为丰富。研究结论:1、S8与S9能通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进大鼠触须部创面的愈合。2、体外分离培养的上皮样细胞为HFSCs。3、S8与S9能通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进HFSCs的增殖。4、S9诱导后的HFSCs能促进皮肤创面修复。