论文部分内容阅读
第一部分鞘氨醇激酶1高表达对APP/PS1双转基因AD模型鼠的作用目的：异常产生和沉积的淀粉样-β蛋白（Aβ）是阿尔茨海默病（AD）发病机制和痴呆的重要原因。有证据表明鞘氨醇-1-磷酸（S1P）/神经酰胺变阻器失衡可能是AD的一种发病机制。本研究的目的是探讨鞘氨醇激酶1的高表达对APP/PS1转基因阿尔茨海默病模型小鼠的影响。方法：由于Sphk1是S1P/ceramide变阻器之间平衡的关键酶，因此本研究中我们采用立体定位注射的方法将靶基因为Sphk1重组腺病毒介导的载体（rAV-Sphk1）注射至海马以评估其对APPsw/PS1双转基因小鼠（APP/PS1）AD模型鼠的作用。用激光共聚焦显微镜观察淀粉样蛋白的沉积；western blot法检测SphK1的表达；酶联免疫吸附试验评估淀粉样蛋白的分泌；水迷宫实验检测小鼠行为学的改变。结果：立体定位注射rAV-Sphk1四个星期后APP/PS1小鼠出现Sphk1蛋白表达升高。同时降低Aβ蛋白的沉积和细胞凋亡程度，水迷宫试验中，小鼠潜伏期明显缩短，且首次穿越第三象限的平均时间及找到平台的次数明显优于其他两组。结论：这些结果表明，Sphk1高表达可以降低老年斑的沉积及环节小鼠行为学的损害，对APP/PS1小鼠起到一定的保护作用。因此，Sphk1高表达在AD的发病机制中起着重要的治疗的作用，通过基因水平干预Sphk1的表达有可能成为治疗AD的新手段。第二部分鞘氨醇激酶1高表达对APP/PS1双转基因AD鼠保护作用的机制目的：第一部分研究发现鞘氨醇激酶1高表达可以降低小鼠老年斑的沉积及缓解其行为学的损害，但是我们尚未清楚Sphk1保护作用的机制。因此本部分的研究目的就是探索鞘氨醇激酶1高表达对APP/PS1双转基因AD鼠保护作用的可能机制。方法：本部分我们采用Western blot法检测Caspase-3蛋白的表达； TUNEL法检测细胞的凋亡。 s1pr1，s1pr3mRNA的表达则通过实时Real time PCR来测定。酶联免疫吸附试验旨在评估CER，S1P的分泌。超微电子显微镜来检测APP/PS1双转基因小鼠模型海马超微结构。结果：立体定位注射rAV-Sphk1四个星期后APP/PS1小鼠出现cer表达减少，S1P表达明显升高，且ceramide/S1P比例下降。电镜结果显示海马超微结构未见明显的细胞核核质边缘化。且Sphk1高表达后caspase-3表达明显下降。而S1Pr1表达升高，且突触后膜SNAP-25蛋白的表达增加突触的活性。结论：这些研究结果表明，Sphk1可以通过capases-3途径抑制细胞凋亡，同时上调S1P受体（S1P-G蛋白偶联受体）及SNAP-25蛋白的表达来提高突触的活性。第三部分小分子RNA干扰鞘氨醇激酶1对APP/PS1双转基因AD鼠的作用目的：阿尔茨海默病是一种随着年龄逐渐进展并最终导致记忆、行为、人格改变的一种神经退行性疾病。之前的研究发现阿尔茨海默病患者存在鞘氨醇代谢异常。且前两部分研究结果显示鞘氨醇激酶1高表达可以有效地降低老年斑的沉积，及凋亡的发生，可以显著改变APP/PS1模型鼠的行为学损害，其从正面证实了鞘氨醇激酶1高表达对APP/PS1双转基因AD模型鼠的保护作用。本研究的目的就是为了从反面证实降低鞘氨醇激酶1的表达能否加快阿尔茨海默病动物模型中老年斑的沉积及损害其学习和记忆能力等的关系。方法：本研究中我们采用小分子干扰鞘氨醇激酶1基因的腺病毒载体进行海马立体定位注射转染APP/PS1小鼠，4周后检测其对APP/PS1小鼠的影响。采用RT-PCR检测鞘氨醇激酶1mRNA及及Western-blot检测鞘氨醇激酶1及caspase-3蛋白的表达，通过Elisa检测神经酰胺及S1P的含量，采用免疫荧光及Elisa来检测老年斑的沉积及水迷宫来检测小鼠行为学的改变。结果：干预组和对照组的鞘氨醇激酶1mRNA及蛋白表达存在明显的差异。干预组小鼠老年斑沉积速度加快，且其学习及记忆能力损害明显加重。结论：siRNA-sphk1的重组腺病毒构建成功,且具有抑制Sphk1蛋白表达的功能,该基因沉默后,促进了APP/PS1双转基因AD模型鼠老年斑的沉积及其学习和记忆能力的损害。第四部分小分子RNA干扰鞘氨醇激酶1对APP/PS1双转基因AD鼠作用机制的研究目的：观察腺病毒介导的鞘氨醇激酶1低表达对APP/PS1双转基因AD模型鼠海马区凋亡的影响，进一步明确sphk1低表达对AD模型鼠作用的可能机制。方法立体定位注射法将携带siRNA-sphk1的腺病毒载体注射至APP/PS1双转基因AD模型鼠海马区,以1X1011pfu/ml的病毒总量分2点注射，对照组海马内注射等量生理盐水，四周后进行检测，观察海马组织凋亡的改变，以及caspase-3表达的改变。结果：注射Sphk1-siRNA的小鼠30d后海马区与对照组相比，转染后TUNEL果显示凋亡程度显著提高，且western-blot结果显示caspase-3表达显著增多。结论：上述结果表明, siRNA-sphk1的重组腺病毒成功沉默sphk1基因后,促进了APP/PS1双转基因AD模型鼠海马区的凋亡。