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冠心病(CHD)是严重威胁人类生命和健康的常见疾病。虽然经皮冠脉成形术(PTCA)和冠状动脉旁路移植术(CABG)挽救了很多患者的生命,但部分严重患者的病情并未因此得到明显改善。近年来基因治疗迅速发展,为冠心病患者提供了一个新的治疗策略,但目前由于尚缺乏一种安全、稳定、高效的基因转染方法,而极大地限制了基因治疗在临床上的广泛应用。新近研究发现,超声靶向破坏微泡定位释放技术(Ultrasound-targeted microbubble destruction, UTMD)是一种新型的无创性基因转移技术。开展对UTMD介导目的基因靶向治疗的深入研究可望为冠心病的基因治疗带来新的治疗措施。本课题是通过构建携有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和肝细胞生长因子(HGF)基因的真核共表达载体(pIRES2-EGFP/HGF),制备一种能与pIRES-EGFP/HGF基因高效结合的超声微泡造影剂,然后运用超声靶向破坏微泡(UTMD)介导HGF治疗大鼠心肌梗死,观察治疗后EGFP及HGF基因在缺血心肌内的表达情况及治疗效果?,为研究和评价超声靶向破坏微泡介导的心脏基因转染提供可靠的实验依据,为冠心病基因治疗提供一个新的途径和手段。本?课题研究主要包括以下三个部分的内容:第一部分增强型绿色荧光蛋白与肝细胞生长因子共表达载体的构建及鉴定目的构建增强型绿色荧光蛋白与人肝细胞生长因子的基因真核共表达载体并鉴定其在真核细胞中的表达。方法在HGF两端设计并合成分别带有SacⅠ和BamHⅠ两酶切位点的一对引物,对pcDNA3.0-HGF载体进行PCR扩增,将扩增出的目的基因与pMD18-T载体相连接,并转化至大肠肝菌,进行菌落PCR、酶切分析和DNA测序鉴定重组克隆。用SacⅠ和BamHⅠ将目的基因片段用双酶切切下后,纯化提取凝胶中的目的DNA片断,然后插入pIRES2-EGFP相应的酶切位点,构建pIRES2-EGFP/HGF真核表达载体并再进行双酶切鉴定。将重组质粒用脂质体法转染至人血管内皮细胞(HUEVC)中,荧光显微镜下观察EGFP在细胞内的表达,Western blot检测HGF蛋白的表达情况。结果重组克隆载体内的目的基因片段序列与GENEBANK上报道的HGF基因序列完全一致,pIRES-EGFP/HGF酶切鉴定结果与预期结果一致。荧光显微镜下观察可见转染后的细胞发出绿色荧光;Western blot结果表明HGF基因得到了有效表达。结论本实验成功构建EGFP和HGF真核共表达载体并可在真核细胞中有效表达。第二部分载基因脂质超声造影剂的制备及其特性的实验研究目的制备一种可作为基因载体的脂质超声造影剂,对其理化性质、兔肾显影效果及载基因能力进行研究。方法采用机械振荡法制备一种可作为基因载体脂质超声微泡造影剂,观察60 Coγ射线灭菌前后造影剂外观、形态、浓度、平均粒径和电位改变,并观察其对正常兔肾显影效果,检测其结合基因的能力。结果自制脂质微泡的平均粒径范围为2.11～6.43μm,平均粒径2.79μm,粒径分布均匀,浓度约为(3.16±0.29)×109个/ml;经60Coγ射线灭菌后在显微镜下观察微泡形态,粒径大小及电位等均无明显变化;体内造影显示该造影剂能够有效增强兔肾实质回声;基因结合量效优化结果显示,造影剂的最大基因结合效率为22%,最大基因结合量为0.45 mg/ml。结论自制脂质超声造影剂符合理想超声造影剂的要求,性质稳定,制备简易,载基因效率高,可望成为一种新型的超声微泡造影剂以及基因或药物治疗的载体。第三部分超声靶向破坏微泡介导HGF促进大鼠梗死心肌血管新生的实验目的探讨超声靶向破坏微泡介导HGF促进大鼠梗死心肌血管新生的可行性,并评价其治疗效果。方法将40只Wistar大鼠制备成心肌梗死模型后随机分为4组,即①HGF+超声+微泡组(HGF+ultrasound+ microbubble, HGF+US/MB),②HGF+超声组(HGF+ultrasound group, HGF+US),③HGF+微泡组(HGF + microbubble group,HGF+MB),④单纯手术组(surgery alone group,SA )。①组采用超声心电触发靶向破坏心肌内携基因微泡,②组采用基因联合超声心电触发,而不用微泡,③组只由静脉输入载基因微泡,④组由静脉注入等量生理盐水作为对照。于基因转染后14 d处死各组大鼠,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在各组大鼠心肌、肝及肾组织内的表达情况,免疫组织化学法(IHC)检测缺血心肌周围CD34的表达,并在显微镜下计数心肌内新生微血管密度(MVD),Western blot和ELISA法检测心肌组织内HGF蛋白表达情况,并对心肌内HGF含量与MVD进行相关性分析。结果荧光显微镜下可见在HGF+US/MB组大鼠心肌中有大量的绿色荧光蛋白的表达,且心室前壁的表达高于后壁,在HGF+US组中仅于小血管及毛细血管的内皮细胞中有少量绿色荧光蛋白的表达,而SA组及HGF+MB组的心肌内无绿色荧光蛋白的表达;各组大鼠肝及肾组织内均未观察到EGFP的表达。IHC结果显示,CD34定位于血管内皮细胞胞膜和胞浆,显示为棕黄色或棕褐色颗粒,新生的微血管被染成棕黄色,显微镜下计数每高倍镜视野下的MVD,结果表明在HGF+US/MB组心肌中MVD最高,为266.9±39.83(个/高倍镜视野),与其它各组相比较均有显著性差异(P<0.01)。Western blot检测结果显示:HGF+US/MB组中可见一69 kD大小蛋白条带表达,HGF+US组可见同等大小的弱蛋白条带表达,而在HGF+MB组及SA组中无明显蛋白条带。ELISA结果显示HGF在HGF+US/MB组心肌中表达最高,为5.54±0.81 ng/g,且前壁表达高于后壁(P<0.05),与其它各组心肌HGF含量相比较均有显著性差异(P<0.01)。相关分析表明,心肌中HGF的含量与MVD呈明显正相关。结论超声靶向破坏微泡可介导HGF基因在缺血心肌内的高效转移并促进血管新生,为心肌梗死的基因治疗提供一个新的措施。