论文部分内容阅读
适时的种子休眠和萌发对植物适应各种环境极为重要。谷物(如小麦、水稻、玉米和大麦)种子的休眠缺陷会导致种子在收获前的高温潮湿天气下提前穗发芽(PHS， pre-harvest sprouting)，严重影响产量和质量；另一方面，促进作物种子萌发对于播种和随后的发芽后生长至关重要。因此，对作物种子萌发与休眠进行研究对农业生产具有重要意义。许多植物激素参与调节种子的萌发，其中脱落酸(ABA)是影响种子萌发与休眠的最重要激素之一。种子中ABA含量的升高能够促进种子休眠，同时ABA合成以及ABA信号通路的激活也会抑制种子萌发。另外，研究发现：许多植物激素通过与ABA的互作参与调节种子萌发。
茉莉酸(JA)是另外一种具有多重生物学功能的植物激素，能够通过与其他激素互作而参与调节植物生长发育以及非生物胁迫应答等许多生物学过程，但JA是否参与种子萌发以及以何种方式参与种子萌发的调节，尚不清楚。JAZ(JasmonateZIM-domain protein)蛋白作为JA信号应答途径中的关键调控因子，在植物的生长发育以及逆境胁迫中发挥着重要的作用。本课题从JAZ蛋白家族功能的研究为切入点，较深入地研究了JAZ蛋白介导JA和ABA互作参与调节种子萌发的分子机制，为阐明植物穗发芽的分子机理提供了新的理论依据。取得的主要研究结果如下：
(1)在全基因组水平鉴定了小麦TaJAZ家族成员并对其特征进行了分析：以拟南芥JAZ蛋白质序列为参考，通过生物信息学的方法检索数据库，在小麦基因组中总共鉴定到了42个TaJAZ家族成员。根据保守氨基酸序列分析我们发现，TaJAZ家族成员都包含ZIM和Jas结构域，并且可以分为三个亚组：GroupI、GroupII和GroupIII。通过对TaJAZ家族成员基因的内含子和外显子结构分析发现，GroupⅠ亚家族成员的结构都很简单，只有一个基因编码区，而GroupⅡ亚家族的大部分成员以及GroupⅢ亚家族的所有家族成员则结构较为复杂。进一步分析发现，小麦TaZAJ家族成员基因在小麦不同发育时期的表达趋势不完全相同，表明这些JAZ蛋白在小麦发育过程中具有不同的功能。最后，通过分析小麦TaJAZ家族基因与拟南芥AtJAZ家族基因的进化关系，我们发现，小麦中TaJAZ1与拟南芥功能研究比较清楚了的AtJAZ3亲缘关系较近，可能具有类似的生物学功能。
(2)小麦TaJAZ1通过与TaABI5互作参与调节种子萌发：与野生型材料KN199相比，TaJAZ1过表达转基因小麦植株的穗发芽率较高，对ABA的敏感性降低，同时在种子萌发过程中ABA响应基因的诱导程度也低于KN199。这表明TaJAZ1是小麦种子穗发芽的正调节因子，ABA信号途径的负调节因子。鉴于ABI5蛋白在植物ABA信号通路中具有重要调控作用，我们克隆了小麦TaABI5基因，通过荧火虫荧光素酶互补成像实验(LCI)以及酵母双杂交实验发现，TaABI5与TaJAZ1在分子水平直接互作，且TaABI5与TaJAZ1的C端(包含Jas结构域)互作。这一研究结果表明，TaJAZ1通过ABA信号转导途径正调节小麦穗发芽以及种子萌发。
(3)拟南芥中AtJAZ3通过与AtABI5互作参与调节种子萌发：与小麦结果相似，在拟南芥中，与野生型材料Col-0相比，转基因过表达材料35S:JAZ3Δjas-GFP的在种子萌发以及子叶变绿中对ABA敏感度降低，对ABA响应基因的诱导程度降低，同时ABI5蛋白的诱导程度也降低。进一步利用LCI实验我们发现，拟南芥中12个JAZ蛋白中，有9个(JAZ2，JAZ3，JAZ5，JAZ6，JAZ8，JAZ9，JAZ10，JAZ11，JAZ12)与ABI5存在互作关系。随后我们以JAZ3为代表，采用BiFC和Co-IP实验进一步证明，JAZ3与ABI5在植物体内存在直接的互作关系。这些研究结果表明，拟南芥AtJAZ3与小麦TaJAZ1类似，可能通过介导ABA信号通路而参与了种子萌发的调节。
(4)JAZ3与ABI5互作调节种子萌发的分子机理解析：首先，通过双荧光素酶报告系统实验以及染色质免疫共沉淀证明拟南芥JAZ3蛋白能够抑制ABI5的转录活性。并且JAZ3蛋白能够在ABA响应基因EM1的启动子区域富集，而ABA处理能够消除拟南芥JAZ3蛋白在该启动子区域的富集作用。进一步实验发现，ABA处理能够促进JAZ蛋白的降解，而JA合成抑制剂菲尼酮能够抑制ABA对JAZ蛋白的降解作用。随后，我们通过转录组测序分析，实时荧光定量实验结合激素水平测定实验发现，ABA处理能够诱导JA合成相关酶基因如AOC2、ACX1、ACX2、以及KAT5的表达，并且能够提高JA的激素水平，但是在abi5-7突变体中ABA处理对JA合成相关酶基因的表达量以及JA激素水平的诱导程度相对较低。这些结果充分表明，JAZ蛋白通过与ABI5直接互作而介导了ABA与JA信号之间的Cross-talk，进而参与调节种子萌发过程。
总之，本研究揭示了JAZ对种子萌发的调节作用及其与ABI5的作用模式，为JA和ABA信号互作调控小麦等作物种子萌发提供了证据，对进一步深入了解小麦等谷物种子萌发调控机制及穗发芽抗性育种具有重要参考价值。
茉莉酸(JA)是另外一种具有多重生物学功能的植物激素，能够通过与其他激素互作而参与调节植物生长发育以及非生物胁迫应答等许多生物学过程，但JA是否参与种子萌发以及以何种方式参与种子萌发的调节，尚不清楚。JAZ(JasmonateZIM-domain protein)蛋白作为JA信号应答途径中的关键调控因子，在植物的生长发育以及逆境胁迫中发挥着重要的作用。本课题从JAZ蛋白家族功能的研究为切入点，较深入地研究了JAZ蛋白介导JA和ABA互作参与调节种子萌发的分子机制，为阐明植物穗发芽的分子机理提供了新的理论依据。取得的主要研究结果如下：
(1)在全基因组水平鉴定了小麦TaJAZ家族成员并对其特征进行了分析：以拟南芥JAZ蛋白质序列为参考，通过生物信息学的方法检索数据库，在小麦基因组中总共鉴定到了42个TaJAZ家族成员。根据保守氨基酸序列分析我们发现，TaJAZ家族成员都包含ZIM和Jas结构域，并且可以分为三个亚组：GroupI、GroupII和GroupIII。通过对TaJAZ家族成员基因的内含子和外显子结构分析发现，GroupⅠ亚家族成员的结构都很简单，只有一个基因编码区，而GroupⅡ亚家族的大部分成员以及GroupⅢ亚家族的所有家族成员则结构较为复杂。进一步分析发现，小麦TaZAJ家族成员基因在小麦不同发育时期的表达趋势不完全相同，表明这些JAZ蛋白在小麦发育过程中具有不同的功能。最后，通过分析小麦TaJAZ家族基因与拟南芥AtJAZ家族基因的进化关系，我们发现，小麦中TaJAZ1与拟南芥功能研究比较清楚了的AtJAZ3亲缘关系较近，可能具有类似的生物学功能。
(2)小麦TaJAZ1通过与TaABI5互作参与调节种子萌发：与野生型材料KN199相比，TaJAZ1过表达转基因小麦植株的穗发芽率较高，对ABA的敏感性降低，同时在种子萌发过程中ABA响应基因的诱导程度也低于KN199。这表明TaJAZ1是小麦种子穗发芽的正调节因子，ABA信号途径的负调节因子。鉴于ABI5蛋白在植物ABA信号通路中具有重要调控作用，我们克隆了小麦TaABI5基因，通过荧火虫荧光素酶互补成像实验(LCI)以及酵母双杂交实验发现，TaABI5与TaJAZ1在分子水平直接互作，且TaABI5与TaJAZ1的C端(包含Jas结构域)互作。这一研究结果表明，TaJAZ1通过ABA信号转导途径正调节小麦穗发芽以及种子萌发。
(3)拟南芥中AtJAZ3通过与AtABI5互作参与调节种子萌发：与小麦结果相似，在拟南芥中，与野生型材料Col-0相比，转基因过表达材料35S:JAZ3Δjas-GFP的在种子萌发以及子叶变绿中对ABA敏感度降低，对ABA响应基因的诱导程度降低，同时ABI5蛋白的诱导程度也降低。进一步利用LCI实验我们发现，拟南芥中12个JAZ蛋白中，有9个(JAZ2，JAZ3，JAZ5，JAZ6，JAZ8，JAZ9，JAZ10，JAZ11，JAZ12)与ABI5存在互作关系。随后我们以JAZ3为代表，采用BiFC和Co-IP实验进一步证明，JAZ3与ABI5在植物体内存在直接的互作关系。这些研究结果表明，拟南芥AtJAZ3与小麦TaJAZ1类似，可能通过介导ABA信号通路而参与了种子萌发的调节。
(4)JAZ3与ABI5互作调节种子萌发的分子机理解析：首先，通过双荧光素酶报告系统实验以及染色质免疫共沉淀证明拟南芥JAZ3蛋白能够抑制ABI5的转录活性。并且JAZ3蛋白能够在ABA响应基因EM1的启动子区域富集，而ABA处理能够消除拟南芥JAZ3蛋白在该启动子区域的富集作用。进一步实验发现，ABA处理能够促进JAZ蛋白的降解，而JA合成抑制剂菲尼酮能够抑制ABA对JAZ蛋白的降解作用。随后，我们通过转录组测序分析，实时荧光定量实验结合激素水平测定实验发现，ABA处理能够诱导JA合成相关酶基因如AOC2、ACX1、ACX2、以及KAT5的表达，并且能够提高JA的激素水平，但是在abi5-7突变体中ABA处理对JA合成相关酶基因的表达量以及JA激素水平的诱导程度相对较低。这些结果充分表明，JAZ蛋白通过与ABI5直接互作而介导了ABA与JA信号之间的Cross-talk，进而参与调节种子萌发过程。
总之，本研究揭示了JAZ对种子萌发的调节作用及其与ABI5的作用模式，为JA和ABA信号互作调控小麦等作物种子萌发提供了证据，对进一步深入了解小麦等谷物种子萌发调控机制及穗发芽抗性育种具有重要参考价值。