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第一部分miRNAs激活膀胱癌细胞p21WAF1/CIP1基因表达及其机制目的：筛选能和抑癌基因p21WAF1/CIP1(p21)启动子区域序列互补且评分较高的miRNAs,观察miRNAs表达水平与临床膀胱癌发生的相关性,检测其对膀胱癌细胞系T24和EJ细胞p21是否有激活效应,并初步探索其激活机制。方法：采用miRanda算法检索p21基因启动子区域和miRBase数据库里所有人miRNAs进行互补配对,寻找评分较高的miRNA;应用实时荧光定量PCR检测10对临床膀胱癌组织和正常膀胱粘膜中这些miRNA和p21基因mRNA的表达水平；生物合成dsControl, dsP21-322, miR-103b mimic, miR-370-5p mimic (miR-370mimic), miR-1180-5p mimic (miR-1180mimic)和miR-1236-3p mimic (miR-1236mimic)(其中dsControl为阴性对照,dsP21-322为阳性对照),通过脂质体转染(终浓度为50nM),在膀胱癌细胞系T24和EJ细胞中过表达这些dsRNAs和miRNAs,72小时后采用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测p21mRNA和蛋白表达水平；通过免疫荧光染色观察p21蛋白亚细胞表达位置；采用亚细胞蛋白提取试剂盒抽提T24和EJ细胞蛋白,Western blot进一步检测p21蛋白在胞浆和胞核表达水平。另外,合成3’或5’端标记生物素的miRNAs以及反义链3’或5’端标记生物素的dsControl,进而转染到T24和EJ细胞内,72小时后采用染色质免疫共沉淀技术(ChIP)检测生物素标记的dsRNA和miRNAs是否与p21启动子相结合。结果：通过miRanda算法检索出miR-103b, miR-370, miR-1180和miR-1236分别与p21启动子区域-907/-887,-552/-537,-397/-379以及-243/-226互补匹配评分较高。实时荧光定量PCR提示相比正常膀胱粘膜细胞,miR-103b在膀胱癌中呈高表达,但差异无显著统计学意义(P>0.05)；miR-370, miR-1180以及miR-1236在膀胱癌中低表达,与正常膀胱粘膜细胞相比,差异均具有显著统计学意义(P<0.05)。p21mRNA在膀胱癌中也呈低表达,和正常膀胱粘膜细胞相比,其差异有显著统计学意义(P<0.05)；行Pearson相关分析,niR-370, miR-1180和miR-1236表达和p21mRNA表达呈正相关,有显著统计学意义；miR-103b表达与p21mRNA表达呈负相关,无显著统计学意义。转染T24和EJ细胞72小时后,实时荧光定量PCR和Western blot显示与Mock和dsControl相比,dsP21-322, miR-370, miR-1180和miR-1236能显著诱导p21mRNA和蛋白表达,miR-103b未能诱导p21高表达。免疫荧光提示dsP21-322, miR-370, miR-1180和miR-1236主要诱导T24和EJ细胞核p21高表达,亚细胞蛋白Western blot检测进一步证实此现象。ChIP实验证实转染72小时后miR-370, miR-1180和miR-1236主要通过与p21基因启动子区域结合,从而激活p21表达。结论：niR-370, miR-1180和miR-1236在人膀胱癌呈低表达,与p21mRNA表达水平呈正相关；miR-370, miR-1180和miR-1236能通过与p21基因启动子直接结合而激活T24和EJ细胞的p21表达,并且主要激活胞核内p21表达。第二部分miRNA通过激活p21基因表达对膀胱癌细胞的抑制作用目的：探讨miR-370, miR-1180和miR-1236对膀胱癌T24和EJ细胞的增殖,周期,凋亡,衰老,集落形成,迁移和侵袭的影响。方法：脂质体转染dsControl, dsP21-322, miR-370mimic, miR-1180mimic和miR-1236mimic到膀胱癌T24和EJ细胞。在转染后72小时提取细胞总RNA,逆转录,利用普通PCR扩增细胞周期调节蛋白(Cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK4和CDK6)的cDNA,琼脂糖凝胶电泳检测Cyclin D1, CDK4和CDK6mRNA的表达水平：流式细胞术检测T24和EJ细胞周期分布和凋亡情况；β-半乳糖苷酶染色观察T24和EJ细胞衰老情况；结晶紫染色观察转染后10天细胞集落形成情况；CellTiter96(?) AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS)检测转染后24小时,48小时,72小时,96小时和120小时等5个时间点细胞增殖情况；Transwell法检测膀胱肿瘤细胞迁移和侵袭能力；共转染特异性抑制p21的干扰RNA(siP21)和miR-1236,琼脂糖凝胶电泳检测p21mRNA表达水平；并观察共转染siP21和miR-1236对细胞周期、集落形成和细胞增殖的影响。结果：在膀胱癌T24和EJ细胞中,与空白对照Mock和阴性对照dsControl转染组相比,转染dsP21-322, miR-370mimic, miR-1180mimic和miR-1236mimic后72小时能显著抑制CDK4, CDK6和Cyclin D1mRNA的表达,诱导细胞周期循环G0/G1期停滞；进一步统计分析显示,相比Mock和dsControl组,两种细胞转染dsP21-322, miR-370mimic, miR-1180mimic和miR-1236mimic后细胞G0/G1期比例升高,其差异有显著统计学意义(P<0.05)；转染72小时,dsP21-322, miR-370mimic, miR-1180mimic和miR-1236mimic转染组处于早期和晚期凋亡的细胞数明显多于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)：并且可以显著的诱导T24和EJ细胞衰老；克隆增值实验表明,相比Mock和dsControl组,dsP21-322, miR-370mimic, miR-1180mimic和miR-1236mimic转染组细胞集落形成数量明显减少,集落面积显著变小,集落形成率显著降低,差异有显著统计学意义(P<0.05); MTS检测提示在转染后第4天(96小时),较Mock和dsControl转染组,dsP21-322, miR-370, miR-1180和miR-1236能显著抑制膀胱癌T24和EJ细胞增殖(P<0.05)；Transwell实验证实,dsP21-322, miR-370,miR-1180和miR-1236较Mock和dsControl能显著抑制T24和EJ细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05)；因在3个miRNA中,miR-1236在膀胱癌组织标本中表达水平最低的,故采用miR-1236进行如下实验。在T24和EJ细胞分别共转染miR-1236mimic和siP21后能显著抑制miR-1236诱导的p21mRNA高表达；并且,siP21可有效消除miR-1236对细胞周期循环、集落形成和细胞增殖的抑制作用。结论：dsP21-322, miR-370mimic, miR-1180mimic和miR-1236mimic转染膀胱癌T24和EJ细胞可抑制Cyclin D1, CDK4和CDK6的表达,诱导肿瘤细胞周期循环停滞于G0/G1期,促进细胞凋亡和衰老,抑制肿瘤细胞集落形成和增殖。此外,miR-1236主要通过激活抑癌基因p21的表达而诱导膀胱癌细胞周期循环G0/G1期停滞,抑制细胞集落形成和增殖能力。