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粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulatingfactor,GM-CSF)是一个具有多项潜能的造血生长因子,不仅能刺激造血祖细胞增殖分化和成熟,而且还能活化树突状细胞及其他单核细胞,在免疫反应中具有重要作用,许多研究证实GM-CSF与DNA疫苗联合免疫,能有效增强DNA疫苗所诱导的免疫应答。马立克病毒(Marek’s disease virus,MDV)的VP22蛋白具有独特的蛋白转导特性,能通过非经典途径从原始表达细胞转导到邻近的非表达细胞中,而且VP22还能使与之融合的外源蛋白在细胞间转导,已被证实具有免疫增强作用。本试验成功克隆了四川山地乌骨鸡GM-CSF基因和MDV的VP22基因,研究了它们对IBV核酸疫苗的佐剂效应,具有重要的学术价值和应用前景,主要研究包括:1.根据GenBank上注册的GM-CSF基因(登录号:AJ621740)序列设计一对引物,采用RT-PCR方法从ConA刺激的四川山地乌骨鸡外周血淋巴细胞总RNA中扩增出鸡GM-CSF基因,克隆入pGEM-T载体,进行序列测定与分析。结果表明,克隆的四川山地乌骨鸡GM-CSF基因全长为435bp,编码144个氨基酸残基。序列分析发现四川山地乌骨鸡GM-CSF(chGM-CSF)基因与其他品种鸡GM-CSF基因核苷酸同源性为99%左右,氨基酸同源率为98%左右,与哺乳动物GM-CSF基因的氨基酸同源性低于30%。蛋白二级预测发现山地乌骨鸡主要含4个α-螺旋,α-螺旋总含量高达55.2%,多处无规卷曲(coil),含量高达36.5%,含有2个β-折叠(strand),含量仅为8.3%,与哺乳动物的GM-CSF二级结构相似,也具有4个α-螺旋,2个β-折叠。四川山地乌骨鸡GM-CSF克隆及序列分析未见相关报道。2.通过PCR方法扩增出不含信号肽的四川山地乌骨鸡GM-CSF成熟蛋白基因,克隆至原核表达载体pET-32a(+),经酶切和测序鉴定正确后,转化入BL21大肠杆菌,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳结果显示融合重组chGM-CSF蛋白主要以包涵体的形式表达,大小约为34 kD左右。通过镍离子金属螯合柱(Ni-NTA)进行重组蛋白纯化,采用纯化后重组蛋白免疫新西兰兔制备兔抗鸡GM-CSF蛋白的多克隆抗体。ELISA结果显示,制备的抗体效价达到了1:3200,Western Blot表明,制备的多克隆抗体能特异性与鸡GM-CSF重组蛋白结合,具有良好的反应原性。本研究获得的chGM-CSF重组蛋白及其多克隆抗体,为研究鸡GM-CSF蛋白生物学功能等提供关键的材料,国内外未见四川山地乌骨鸡GM-CSF基因的原核表达及抗体制备的相关报道。3.通过酶切、连接等方法,将四川山地乌骨鸡GM-CSF基因亚克隆到真核表达载体pVAX1上以构建质粒pVAX1-chGM-CSF,利用菌落PCR和酶切对重组质粒进行鉴定,采用脂质体法转染哺乳动物COS-7细胞,采用间接免疫荧光试验(IFA)和RT-PCR检测质粒在体外的表达情况,收集质粒转染70 h后上清中表达蛋白,通过骨髓细胞增殖试验检测表达的chGM-CSF蛋白的生物学活性。RT-PCR结果显示转染了pVAX1-chGM-CSF质粒的COS-7细胞中能特异性扩增出GM-CSF基因片断,间接免疫荧光分析表明转染了pVAX1-chGM-CSF质粒的COS-7细胞显示出苹果绿荧光,而转染了空质粒pVAX1的细胞则没有显示出任何特异荧光。骨髓细胞增殖试验表明chGM-CSF蛋白能明显促进鸡骨髓细胞的增殖,这些结果为研究chGM-CSF对DNA疫苗佐剂效应提供了关键材料和奠定了理论基础,目前国内未见在COS-7细胞中表达四川山地乌骨鸡GM-CSF及表达蛋白活性分析的相关报道。4.本研究根据发表的马立克病毒VP22的序列(登录号:L10283),设计了一对特异性引物,采用PCR方法从MDV弱毒株的基因组中扩增VP22基因。再根据IBV结构基因S1、M、N序列(登录号:DQ288927),设计引物通过PCR方法扩增出IBV结构基因S1、M、N,分别克隆入真核表达载体pVAX1,酶切鉴定正确后,再通过双酶切,电泳胶回收后与同样酶切处理的VP22片断相连,构建融合表达质粒pVAX-VP22/S1、pVAX-VP22/M、pVAX-VP22/N,酶切和测序鉴定后,通过脂质体转染COS-7细胞,转染40 h后,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测重组蛋白在COS-7细胞中的表达。RT-PCR检测结果显示转染了融合表达质粒的COS-7细胞中分别扩增出S1、M、N基因片断,间接免疫荧光分析表明转染了融合表达质粒的COS-7细胞显示苹果绿荧光,而转染了空质粒pVAX1的细胞则没有显示出任何特异荧光。目前国内外未见马立克病毒VP22基因与IBV结构蛋白基因融合表达载体的构建及在COS-7细胞中表达的研究报道。5.为研究chGM-CSF及VP22基因对IBV DNA疫苗的佐剂效应和比较chIL-2、chIL-8、chGM-CSF对DNA疫苗的佐剂效应差异,将大量提取的真核表达质粒,纯化后分别与脂质体溶液混合配制成DNA疫苗,通过腿部肌肉多点注射7日龄雏鸡,21日龄加强免疫一次。在免疫前和免疫后0、7、14、21、28 d采血检测ELISA抗体效价和外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的数量,并在二免后第10d,采用MTT、法检测脾淋巴细胞增殖水平。二免两周后用IBV强毒进行攻毒,观察两周,记录发病及死亡情况,评价疫苗免疫保护力。抗体水平检测结果显示, VP22融合疫苗组pVAX-VP22/S1、pVAX-VP22/M、pVAX-VP22/N产生的抗体水平一直高于对照组pVAX-S1、pVAX-N、pVAX-M,从免疫后第14 d开始,差异显著(P＜0.05),chGM-CSF分子佐剂组pVAX-chGM-CSF+pVAX-S1、pVAX-chGM-CSF+pVAX-N、pVAX-chGM-CSF+pVAX-M抗体水平从免疫后第7 d开始明显高于对照组pVAX-S1、pVAX-N、pVAX-M,且差异显著(P＜0.05),chGM-CSF+pVAX-S1疫苗组产生的抗体水平高于chIL-2+pVAX-S1、chIL-18+pVAX-S1疫苗组,从免疫后第7 d开始差异显著(P＜0.05);脾淋巴细胞增殖实验显示,VP22融合疫苗组和chGM-CSF分子佐剂组都能有效刺激脾淋巴细胞的增殖,增殖指数高于对照组,且差异显著(P＜0.05),chGM-CSF+pVAX-S1疫苗组淋巴细胞增殖指数高于chIL-2+pVAX-S1、chIL-18+pVAX-S1组,且差异显著(P＜0.05),其中pVAX-chGM-CSF+pVAX-S1组增殖指数最高,平均值达2.83;外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量检测结果显示,VP22融合疫苗组淋巴细胞亚群数量免疫后高于对照组,在免疫后21 d开始,差异显著(P＜0.05),chGM-CSF分子佐剂组在免疫后明显高于对照组,从免疫后第7 d开始差异显著(P＜0.05),chGM-CSF+pVAX-S1疫苗组免疫后明显高于chIL-2+pVAX-S1、chIL-18+pVAX-S1组,从免疫后第7d开始差异显著(P＜0.05);攻毒结果表明,chGM-CSF分子佐剂组保护率介于80～90%,高于VP22融合表达的疫苗组的75～80%和对照组65～75%,其中pVAX-chGM-CSF+pVAX-S1为所有组最高,达到了90%,也高于chIL-2+pVAX-S1、chIL-18+pVAX-S1的85%和80%。这些结果表明,chGM-CSF、VP22作为分子免疫佐剂能提高IBV DNA疫苗体液和细胞免疫水平,提高疫苗的攻毒保护率,chGM-CSF对IBVDNA疫苗免疫增强效应要略优于chIL-2、chIL-18。本研究开展的四川山地乌骨鸡GM-CSF和MDV的VP22基因的克隆、表达以及对IBV核酸疫苗佐剂效应的研究,为进一步研制新型、高效、安全禽类DNA疫苗的分子佐剂提供理论依据。