研究背景与意义:胃癌(gastric cancer)是世界范围内第五大流行的恶性肿瘤,同时其引起的相关死亡在癌症领域内位列第三。据2015年发表的《Global cancer statistics,2012》的最新统计数据显示:在2012年全球范围内预估胃癌新发患者有951600例,胃癌患者死亡病例为723100例。尽管在胃癌的诊断治疗领域取得了不断的进展,但我国胃癌患者的5年生存率仍旧较低,且恶性胃癌的中位生存期仍然没有显著的提高。因此,深入研究胃癌发生进程中的分子机制,为胃癌患者提供新的诊断治疗方式和策略具有重要的意义。芯片和高通量测序技术对基因组和转录组学的研究表明仅少于2%的基因组用来编码蛋白,而大于75%的基因组被激活转录为非编码RNAs。新近研究表明,肿瘤基因组中的多个突变位点位于非编码蛋白的区域,而这些区域通常会转录为微小RNAs(mi RNAs)和长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)。二代测序结果表明,多个miRNAs和lncRNAs的表达异常与多种肿瘤的发生与进程相关,这些异常表达的mi RNAs和lncRNAs在基因表达调控方面发挥重要作用,因此它们能够调控细胞稳态的多个方面,其中包括细胞的增殖,存活,迁移以及基因组的稳定性。Mi RNAs通过碱基互补配对靶向作用于编码蛋白mRNA的3’UTR,从而降解m RNAs或抑制m RNA的翻译,而在转录后水平调控基因表达。Mi RNAs表达异常与多种肿瘤的进程相关,其作用机理是通过调控原癌基因和抑癌基因表达而参与肿瘤的发生与进程。在胃癌中,多种mi RNAs参与调节细胞的增殖,凋亡和侵袭,而与胃癌的发生,演进,转移以及预后密切相关。lnc RNAs的转录受制于组蛋白修饰介导的调控而其成熟受经典剪切子作用,lnc RNAs表达具有细胞和组织特异性。lncRNAs在功能方面的研究表明,其可调控蛋白质与蛋白质,DNA之间的相互作用,发挥增强子的功能调控基因转录,可以识别互补序列,发挥海绵吸附作用。最新研究提示lnc RNAs参与了癌症的发生与进程,可以调控细胞周期,存活,免疫应答,细胞干性或肿瘤细胞转化,而在肿瘤的发生与进程中发挥促肿瘤或抑制肿瘤的功能。尽管现阶段研究提示非编码RNAs参与调控胃癌的发生与进程,但大量非编码rnas(mirnas和lncrnas)在胃癌中表达和功能调控分子机制仍旧不清楚。阐明非编码rnas在胃癌中的作用及其分子机制,将丰富我们对胃癌的发生与进程的认识,同时也将为胃癌的诊断和治疗提供了新的理论依据和实验基础。研究方法:第一部分:mir-141靶向调控taz抑制胃癌生长、侵袭和转移的分子作用机制研1.高通量转录组芯片测定4例胃癌患者配对的癌组织和癌旁组织的mirnas谱,采用atc进行差异表达mirnas的筛选和数据挖掘。差异mirnas的筛选标准是:p值≤0.05且倍数改变≥1.5。2.采用qrt-pcr检测36例配对胃癌组织和癌旁组织mir-141表达水平,比较mir-141在癌组织与癌旁组织的表达差异,并结合临床数据分析mir-141与胃癌患者临床病理转移的相关性。3.为评价mir-141对胃癌细胞肿瘤表型的影响,在hgc-27细胞中分别转染mimicscontrol、mir-141mimics;在ags细胞中分别转染anti-mir-control和anti-mir-141。采用cck-8增殖、划痕、transwell侵袭转移实验评价各组胃癌细胞增殖、侵袭和转移能力。4.为鉴定mir-141的靶基因,采用生物信息学软件targetscan预测mir-141的靶基因,并构建pmir-taz-3′utr和mutantpmir-taz-3′utr质粒载体,双荧光素酶报告基因实验鉴定mir-141是否与taz3′utr结合。5.采用qrt-pcr检测36例配对胃癌组织和癌旁组织taz表达水平,比较taz在癌组织和癌旁组织的差异,并结合mir-141表达水平,分析mir-141与taz表达水平的相关性。6.为评价taz对胃癌细胞肿瘤表型的影响,hgc-27细胞和sgc-7901细胞转染sirnacontrol、tazsirna、pcdna3.1质粒,或pcdna3.1-taz质粒后,采用cck-8增殖、transwell侵袭转移实验评价各组胃癌细胞增殖、侵袭和转移能力。7.为评价mir-141对胃癌体内生长和转移的影响,hgc-27细胞分别转染agomir-nc和agomir-141,24h后,收集细胞注射到裸鼠腋窝,每间隔7天测定移植瘤的体积,35天后取出移植瘤并测定重量。此外,尾静脉注射前述的两组细胞,35天后,取出肺脏组织he染色,观察是否有胃癌细胞在肺部形成转移灶,并计数有转移灶形成的裸鼠只数。第二部分:mir-22靶向调控mmp14和snail抑制胃癌生长和转移的分子作用机制研究1.采用qrt-pcr检测61例配对胃癌组织和癌旁组织mir-22表达水平,比较mir-22在癌组织与癌旁组织的表达差异。结合临床数据分析mir-22与胃癌患者临床病理分期分级,转移和预后生存率的相关性。2.为评价mir-22对胃癌细胞肿瘤表型的影响,在sgc-7901细胞中分别转染mimicscontrol和mir-22mimics,在ags细胞中分别转染anti-mir-control和anti-mir-22后,分别采用cck-8增殖、划痕、transwell侵袭转移实验评价不同组别胃癌细胞增殖、侵袭和转移能力。3.为鉴定mir-22的靶基因,采用生物信息学软件targetscan预测mir-22的靶基因,并构建pmir-mmp14(snail)-3′utr和mutantpmir-mmp14(snail)-3′utr质粒载体,双荧光素酶报告基因实验鉴定mir-22是否与mmp14(snail)3′utr结合。4.采用qrt-pcr检测61例配对胃癌组织和癌旁组织mmp14(snail)表达水平,并结合mir-22表达水平,分析mir-22与mmp14(snail)表达水平的相关性。5.为评价mmp14(snail)对胃癌细胞肿瘤表型的影响,sgc-7901细胞和hgc-27细胞转染sirnacontrol、mmp14(snail)sirna、pcdna3.1质粒,或pcdna3.1-mmp14(snail)质粒后,采用transwell侵袭转移实验评价各组胃癌细胞侵袭和转移能力。6.为评价mir-22对胃癌体内生长、播散和转移的影响,sgc-7901细胞分别转染agomir-nc和agomir-22,24h后收集细胞注射到裸鼠腋窝,每间隔7天测定移植瘤的体积,35天后取出移植瘤并测定重量。对于腹腔播散模型,腹腔注射前述的两组细胞在注射后的35天,计数腹腔中肉眼可见的肿瘤结节。在肺转移模型中,尾静脉注射前述的两组细胞,35天后,取出肺脏组织he染色,观察是否有胃癌细胞在肺部形成转移灶,并计数有转移灶形成的裸鼠只数。第三部分:长链非编码rnapvt1促进胃癌侵袭转移的作用机制研究1.高通量转录组芯片测定4例胃癌患者配对的癌组织和癌旁组织的lncrnas谱,采用atc进行差异表达lncrnas的筛选和数据挖掘。差异lncrnas的筛选标准是:p值≤0.05且倍数改变≥1.5。2.采用qrt-pcr检测42例配对胃癌组织和癌旁组织pvt1表达水平,比较pvt1在癌组织与癌旁组织的表达差异,并结合临床数据分析pvt1与胃癌患者分期分级、转移的相关性。3.为评价pvt1对胃癌细胞肿瘤表型的影响,在ags细胞中分别转染pcdna3.1质粒和pcdna3.1-pvt1质粒。采用划痕、transwell侵袭转移实验评价两组胃癌细胞迁移、侵袭和转移能力。4.为评价pvt1对emt的影响,在ags细胞中分别转染pcdna3.1质粒和pcdna3.1-pvt1质粒。采用免疫荧光,qrt-pcr和westernblotting检测两组细胞e-cadherin、n-cadherin、snail、zeb1和zeb2的变化。5.为评价pvt1对胃癌体内生长和转移的影响,分别构建ags-zpp稳转细胞株(对照)和ags-pvt1稳转细胞,将两组细胞注射到裸鼠腋窝,35天后取出移植瘤测定体积和重量。此外,尾静脉注射前述的两组细胞,35天后,取出肺脏组织he染色,观察是否有胃癌细胞在肺部形成转移灶,统计出现转移灶的数目。6.为证实pvt1与mir-30a结合,采用生物信息学软件targetscan预测pvt1潜在结合的mirnas,rip和双荧光素酶报告基因实验鉴定pvt1是否与mir-30a结合。研究结果:第一部分:mir-141靶向调控taz抑制胃癌生长、侵袭和转移的机制研究结果1.转录组芯片筛选16个mirnas在癌组织和癌旁组织差异表达显著,具有显著性统计学差异,(筛选标准:p≤0.05且倍数改变≥1.5)。2.qrt-pcr检测发现mir-141在胃癌组织相比较于癌旁组织,其表达降低,具有显著性统计学差异(p<0.001),且与胃癌的转移相关。3.cck-8增殖,划痕和transwell侵袭转移实验显示,mir-141mimics组与mimicscontrol组比,抑制了hgc-27细胞的增殖、侵袭和转移,具有显著性统计学差异(p<0.05)。anti-mir-141组与anti-mir-control组相比,促进ags细胞的增殖、侵袭和转移,具有显著性统计学差异(p<0.05)。4.生物信息学targetscan预测,转录组mrna芯片筛选,双荧光素酶报告基因实验显示mir-141能够靶向结合taz3′utr,表明hippo通路taz是mir-141靶基因。5.taz在胃癌组织相比较于癌旁组织,其表达上调2.01倍,具有显著性统计学差异(p<0.01)。相关性分析发现36例胃癌组织中taz与mir-141的表达呈负相关(r=-0.507,p<0.01)。6.taz干扰和过表达实验结果显示,si_taz组与对照si_con组相比,胃癌细胞增殖、侵袭和转移能力受到抑制,均具有显著性统计学差异(p<0.05)。与pcdna3.1空载体组相比,pcdna3.1-taz组胃癌细胞增殖、侵袭和转移能力增强,均具有显著性统计学差异(p<0.05)。回复实验发现taz能够逆转mir-141对胃癌细胞肿瘤生物学功能表型的抑制。7.裸鼠移植瘤模型显示,与agomir-nc-hgc-27组相比,agomir-141-hgc-27组的肿瘤体积、质量均降低,均具有显著性统计学差异(p<0.05)。肺转移动物模型实验发现,agomir-nc-hgc27组中,7(n=8)只裸鼠肺组织可观察到转移灶;agomir-141-hgc27组中2(n=8)只裸鼠肺组织可观察到转移灶;fisher检验分析发现两组间有显著差异(p<0.05)。该结果表明,mir-141能够抑制体内胃癌细胞的生长和远端肺转移。第二部分:mir-22靶向调控mmp14和snail抑制胃癌生长和转移的机制研究结1.qrt-pcr检测发现mir-22在胃癌组织相比较于癌旁组织,其表达显著降低,差异具有统计学意义(p<0.001),且与胃癌的分期分级,转移相关。mir-22低表达组胃癌患者的总生存率显著低于mir-22高表达组患者的总生存率,差异具有统计学意义(p<0.05),表明下调的mir-22与胃癌不良生存率相关。2.cck-8增殖,划痕和transwell侵袭转移实验显示,mir-22mimics组与mimicscontrol组比,抑制了sgc-7901细胞的增殖、侵袭和转移,具有显著性统计学差异(p<0.05)。anti-mir-22组与anti-mir-control组相比,促进了ags细胞的增殖、侵袭和转移,具有显著性统计学差异(p<0.05)。3.生物信息学targetscan预测,转录组mrna芯片筛选,双荧光素酶报告基因实验显示mir-22能够靶向结合mmp14和snail3′utr,表明mmp14和snail是mir-22靶基因。4.相关性统计分析发现61例胃癌组织中mmp14的mrna表达水平与mir-22的表达呈负向相关(r=-0.366,p<0.01);snail的mrna表达水平与mir-22的表达也呈负向相关(r=-0.444,p<0.01)。5.mmp14和snail干扰和过表达实验结果显示,si_mmp14(snail)组与对照si_con组相比,胃癌细胞侵袭和转移能力受到抑制,均具有显著性统计学差异(p<0.05)。与pcdna3.1空载体组相比,pcdna3.1-mmp14(snail)组胃癌细胞增殖、侵袭和转移能力增强,均具有显著性统计学差异(p<0.05)。回复实验发现mmp14(snail)能够逆转mir-141对胃癌细胞肿瘤生物学功能表型的抑制。6.裸鼠移植瘤模型显示,与agomir-nc-sgc-7901组相比,agomir-22-sgc-7901组的肿瘤体积、质量均降低,均具有显著性统计学差异(p<0.05)。裸鼠腹腔播散模型结果显示,agomir-22-sgc-7901组腹腔播散的肿瘤结节数目显著低于agomir-nc-sgc-7901组,均具有显著性统计学差异(p<0.05)。肺转移动物模型实验发现,agomir-nc-sgc-7901组中,9(n=10)只裸鼠肺组织可观察到转移灶;agomir-22-sgc-7901组中3(n=10)只裸鼠肺组织可观察到转移灶;fisher检验分析发现两组间有显著差异(p<0.05)。该结果表明,mir-22能够抑制体内胃癌细胞的生长,腹腔播散和远端肺转移。第三部分:长链非编码rnapvt1促进胃癌侵袭转移的机制研究结果1.转录组芯片筛选50个lncrnas在癌组织和癌旁组织差异表达显著,具有显著性统计学差异,(筛选标准:p≤0.05且倍数改变≥1.5)。2.qrt-pcr检测发现pvt1在胃癌组织相比较于癌旁组织,其表达上调,具有显著性统计学差异(p<0.05),且与胃癌的分期分级、转移相关。3.划痕和transwell侵袭转移实验显示,pcdna3.1-pvt1组与pcdna3.1组比,显著促进了ags细胞的迁移、侵袭和转移,差异均具有统计学意义(p<0.05)。4.免疫荧光,qrt-pcr和免疫印迹结果显示,pcdna3.1-pvt1组与pcdna3.1组比,过表达pvt1抑制了e-cadherin表达,而促进n-cadherin,snail,zeb1和zeb2表达,提示pvt1影响了emt相关分子的表达。5.裸鼠移植瘤模型显示,lv-pvt1组的肿瘤体积、质量显著高于对照lv-control组,差异均具有统计学意义(p<0.05)。肺转移动物模型实验发现,lv-pvt1组肺组织中的转移灶数量显著高于对照lv-control组,差异具有统计学意义(p<0.01)。该结果表明,稳定表达pvt1能够促进胃癌细胞株体内的生长和远端肺转移。6.生物信息学targetscan预测,rna共沉淀和双荧光素酶报告基因检测证实pvt1能够结合mir-30a,提示pvt1可能发挥mirnas分子海绵吸附功能。相关性分析发现pvt1的表达与snail的表达呈正相关(r=0.622,p<0.01)。研究结论:第一部分:mir-141靶向调控taz抑制胃癌生长、侵袭和转移的分子作用机制研系统筛选鉴定了胃癌相关mirnas,确定mir-141是潜在的胃癌抑癌mirna。其发挥抑癌作用,至少部分是依赖于其靶向调控的hippo通路组成因子taz。首次证实mir-141/taz轴调控胃癌细胞增殖,迁移和侵袭。该发现丰富了我们对胃癌的病理发生的理解,也为胃癌治疗提供了新靶点。第二部分:mir-22靶向调控mmp14和snail抑制胃癌生长和转移的分子作用机制研究该研究阐明了mir-22在胃癌中发挥肿瘤抑制的功能机制。其主要作用机制包括两方面,一方面是miR-22表达下调,促进MMP14表达上调,激活MMP2,介导了ECM重塑。另一方面,miR-22表达下调,促进Snail表达上调,抑制了E-cadherin表达,介导了EMT发生,促进胃癌侵袭转移。该研究首次阐释mi R-22-MMP14/Snail轴在调控胃癌细胞增殖,侵袭和转移方面的作用。该发现将为胃癌的诊断治疗提供新的思路和理论基础。第三部分:长链非编码RNA PVT1促进胃癌侵袭转移的作用机制研究系统筛选鉴定了胃癌相关lnc RNAs,阐释了PVT1在胃癌中促进肿瘤侵袭转移的作用机制。PVT1能够发挥mi RNAs分子海绵的功能,结合mi R-30a后,抑制miR-30a对靶标分子Snail的调控,而提高Snail表达,促进胃癌细胞EMT发生。该研究首次阐释PVT1-mi R-30a-Snail轴在调控胃癌细胞侵袭和转移方面的作用。该发现对我们理解lnc RNAs在胃癌中的作用提供了新的认识,同时也为胃癌的治疗提供了理论依据和实验基础。