稻飞虱是水稻重要害虫,造成严重的经济损失。目前防治稻飞虱的主要手段仍然是化学防治。然而,化学杀虫剂的广泛使用,使其对有机氯、有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯及新烟碱类等杀虫剂产生了抗性,同时也加快了昆虫对新型杀虫剂产生抗性的速度。害虫抗药性的分子机制主要包括靶标敏感性降低和解毒代谢作用增强两个方面。其中,靶标通过突变或者量变导致其与杀虫剂结合能力发生变化,使昆虫对杀虫剂产生抗性。另一方面,细胞色素P450单加氧酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽转移酶等解毒代谢酶通过基因扩增、表达量增加及酶活性增强来提高昆虫对杀虫剂的解毒代谢能力,产生代谢抗性。细胞色素P450是超基因家族,存在于所有生物体内。昆虫P450不仅参与合成和代谢保幼激素、蜕皮激素等多种内源化合物,还能够代谢植物毒素、杀虫剂等外源化合物。P450作为一种多功能氧化酶,能够代谢几乎所有种类的杀虫剂,在害虫抗药性中发挥重要作用。虽然在实验室筛选的褐飞虱品系中发现烟碱型乙酰胆碱受体突变或者量变能够导致褐飞虱对吡虫啉产生抗性,但该机制在田间抗性种群中并不普遍。在田间抗性种群中,P450.在褐飞虱对吡虫啉抗药性中发挥重要作用。本文以稻飞虱为研究对象,一方面利用杀虫剂对敏感品系稻飞虱进行连续筛选获得抗性品系,并寻找抗性品系中过量表达的P450基因;另一方面通过药剂诱导敏感品系稻飞虱,寻找被诱导后表达量发生变化的P450基因。结合两个方面的研究结果,通过RNAi和体外表达代谢实验共同分析P450在稻飞虱对吡虫啉抗性中的作用,以及与其他杀虫剂交互抗性的关系。一、吡虫啉对褐飞虱P450基因的诱导表达分析褐飞虱基因组中共发现54个P450基因,而目前报道与吡虫啉抗药性相关的P450基因只有两个(CYP6ER1和CYP6AY1),可能有更多的P450基因与吡虫啉抗性有关。田间检测发现,8个田间种群对吡虫啉都存在不同水平的抗性,尤其是湖州种群和无锡种群,对吡虫啉的抗性分别达到了 71.83倍和82.26倍。增效剂试验结果表明,PBO对8个田间种群均具有明显的增效作用,说明P450在褐飞虱抗吡虫啉中具有重要作用,其中湖州种群中PBO的增效作用最为显著。通过比较吡虫啉处理前后敏感品系褐飞虱P450基因的表达量差异,发现18个P450基因诱导后出现表达量上调,其中8个属于CYP3Clade,8个属于CYP4Clade,2个属于CYP2Clade,MitoClade中没有基因被诱导表达量上调。在这些被诱导上调的 P450 基因中有 8 个基因(CYP4CE1、CYP417A1、CYP425B1、CYP6AX1、CYP6AY1、CYP6CS1、CYP6CW1和CYP6ER1)上调比率超过2倍,并且都属于CYP3 和 CYP4Clade;CYP6CS1、CYP6CW1 和 CYP6ER1 这 3 个基因上调比率超过4倍,并且均属于CYP3Clade中的CYP3家族。在湖州种群中,除CYP6AX1外,以上检测8个P450基因(吡虫啉处理后敏感品系中表达量上调2倍以上)的表达量均显著高于敏感品系,其中差异最大的3个基因分别是CYP6CS6(9.8倍)、CYP6ER61(7.7倍)和C)和CYP6AY1(5.1倍)。吡虫啉处理湖州种群48h后,除了 CYP425B1外,其余7个P450基因表达量上调的比率都低于敏感品系。结果表明,在敏感和抗性水平较低的种群中,与抗药性相关的P450基因容易被诱导;而在抗性种群中,由于其P450本底表达量高,所以进一步的诱导表达比较困难。二、多个P450基因共同介导褐飞虱对吡虫啉的代谢抗性烟碱型乙酰胆碱受体靶标位点突变或者靶标亚基表达量变化导致的褐飞虱对吡虫啉的抗药性已经在实验室抗性品系中被证实,然而在田间种群中P450介导的代谢抗性仍然是褐飞虱对吡虫啉抗性的主要机制。根据生测结果将一个田间褐飞虱种群分为两个品系:一是通过吡虫啉连续筛选25代,获得的抗性品系(G25);另一个是未接触任何杀虫剂连续饲养25代,得到的相对敏感的品系(S25,抗性倍数为2倍)。增效剂试验结果表明,PBO、TPP和DEM对S25都不具有增效作用;PBO和TPP对G25都具有增效作用,并且PBO对其增效作用最显著,增效倍数达到5.88倍,因此推断P450在褐飞虱对吡虫啉抗性中发挥重要作用。比较G25和S25品系中所有P450基因表达量差异发现:与S25相比,G25中12个P450基因过量表达,其中6个属于CYP4Clade,5个属于CYP3Clade,1个属于 MitoClade,CYP2Clade 中没有基因过量表达。CYP6AY1、CYP6ER1、CYP6CS1、CYP6CW1、CYP4CE1和CYP425B1表达量超过5.0倍。通过RNA干扰分别降低G25 品系中的 CYP6AY1、CYP6ER1、CYP6CW1 和 CYP4CE1 mRNA 表达量后,G25对吡虫啉的敏感性均显著上升。体外重组的CYP6AY1、CYP6ER1、CYP6CW1和CYP4CE1均能够代谢吡虫啉,但其代谢能力存在显著差异。为分析4个P450基因在褐飞虱对吡虫啉抗性发展的不同阶段中的作用,检测了经吡虫啉连续25代筛选的褐飞虱品系中的4个P450基因的表达动态。根据过量表达结果推测,CYP6ER1在抗性发展所有阶段都具有重要作用,其他的几个P450基因仅仅在抗性发展的某个发展的某个阶段发挥重要作用。结果表明,探索P450在抗药性中的作用时需要综合考虑抗药性个体P450基因过量表达、抗性发展不同阶段P450表达的变化及其对吡虫啉的催化活性等因素。三、两种新烟碱类杀虫剂对褐飞虱和白背飞虱P450基因诱导表达褐飞虱和白背飞虱是水稻上重要的害虫,常混合发生,吡虫啉对其具有良好的杀虫效果而被广泛应用,从而导致了抗药性的产生。因而选择新的替代的药剂十分重要,环氧虫啶为新的顺式硝基新烟碱类杀虫剂,对敏感和抗吡虫啉褐飞虱都具有较好的杀虫活性。由于环氧虫啶极易被水解其中间体(NMI),本文比较了不同剂量吡虫啉和NMI对褐飞虱和白背飞虱P450基因诱导作用的异同点。在白背飞虱中,相同剂量(LD85)的吡虫啉和NMI分别处理白背飞虱后,大部分P450基因的mRNA表达量变化情况是一致的,包括9个P450基因表达量上调及3个P450基因表达量下调。相同剂量(LD85)的吡虫啉分别处理白背飞虱和褐飞虱后,12对P450同源基因中10对显示出相同的被诱导模式,其中7对同源基因被诱导表达量上调,1对同源基因被诱导表达量下调以及2对同源基因被诱导后表达量没有显著差异。相比之下,LD15、LD50和LD85三种剂量的吡虫啉处理同一种昆虫(褐飞虱)后,P450被诱导的情况显示出多样性,如4个P450基因能够被三种剂量诱导上调,然而其他9个基因被诱导表达的情况因剂量不同而异。尽管CYP6AY1和CYP6ER1都与褐飞虱对吡虫啉抗药性相关,但是CYP6AY1基因被三种不同剂量吡虫啉诱导表达量上调,而CYP6ER1只被LD5o剂量诱导表达量上调。总之,两种飞虱在应对杀虫剂的选择压力时,P450基因表现出相似的调控模式,尽管调控因剂量不同而异。四、吡虫啉和吡蚜酮在褐飞虱中的交互抗性研究近些年,吡蚜酮成为防控褐飞虱的主要杀虫剂品种之一,因此研究高抗吡虫啉的褐飞虱种群对吡蚜酮的交互抗性对该药剂使用、褐飞虱高效化学防控都非常重要。对两个地区的褐飞虱种群连续5年的监测发现,吡虫啉抗性均呈现逐年降低的趋势,而吡蚜酮抗性则逐年上升。在所有的田间种群中,增效剂PBO对两种杀虫剂都具有增效作用,证明P450在两种杀虫剂抗药性中具有重要作用。褐飞虱CYP6AY1和CYP6ER1在对吡虫啉抗药性中发挥重要作用,并且其重组蛋白在体外能够有效代谢吡虫啉,然而对吡蚜酮不具有活性。通过RNA干扰分别降低田间种群中CYP6AY1和CYP6ER1的mRNA表达量后,褐飞虱对吡蚜酮的敏感性没有变化,但是对吡虫啉的敏感性却显著增加。以上研究表明,对吡虫啉具有高水平抗性的褐飞虱种群对吡蚜酮不具有显著的交互抗性,这与烟粉虱中的发现不同。