STS诱导心肌细胞VSOR Cl-通道的电生理学特性及其与PI3K/Akt信号分子的关系

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氯离子是机体内最重要,最丰富的阴离子,而主要介导这一离子流动的容积敏感性外向整流性(volume-sensitive outwardly rectifying,VSOR)Cl-通道不仅参与了细胞容积的调节、细胞的增殖、分化与凋亡以及动作电位的产生等多种生理、病理过程,而且在细胞凋亡相关的疾病,如心力衰竭、心肌梗死及心律失常等多种心血管疾病的发生与发展中发挥着至关重要的作用。凋亡又称程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD),细胞凋亡早期细胞体积减小即凋亡性容积减小(apoptotic volume decrease,AVD),是凋亡的一个重要的形态学特征。近年来,大量证据提示AVD及激活的氯离子通道在细胞凋亡过程中起着重要的作用,是细胞凋亡的重要前提;多种细胞类型在多种凋亡刺激的情况下,其中包括凋亡受体介导的细胞外途径和线粒体介导的细胞内途径,通过阻断激活的VSOR Cl-通道及细胞体积减小可以抑制细胞凋亡,膜片钳实验同样证实细胞凋亡伴有容积敏感性氯电流(volume-sensitive Cl- current,ICl,Vol)或膨胀激活性氯电流(swelling-activated Cl- current,ICl,Swell)的激活,阻断激活的该氯电流能抑制或减轻细胞凋亡,但是其内在的信号机制尚不清楚。十字孢碱(staurosporine,STS)是一种蛋白激酶C(PKC)的抑制剂,我们前期应用分子生物学的实验研究已经证明了STS诱导的心肌细胞凋亡过程中,VSOR Cl-通道阻断剂能够有效抑制心肌细胞的凋亡,且PI3K/Akt(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B)信号分子参与了保护心肌细胞的机制。但是尚缺乏电生理研究的直接证据,这正是本研究的目的。研究目的:1.在心肌细胞上应用全细胞膜片钳技术观察STS是否能够诱导产生ICl,Vol电流及其电生理学特性。2.观察氯离子通道阻断剂DIDS及特异性VSOR Cl-通道阻滞剂DCPIB对STS诱导该电流产生的影响。3.通过应用PI3K/Akt信号分子的特异性抑制剂LY294002及其激动剂Insulin,观察PI3K/Akt信号分子是否参与了STS诱导ICl,Vol电流的调控。研究方法:1.原代培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,实验设立阴性对照组(等渗组),正常对照组(低渗组),阳性对照组(STS组),及实验组(低渗+ DIDS/DCPIB组,STS+DIDS/DCPIB组,STS+LY294002/Insulin组)。每组相同实验重复5个细胞及以上。2.应用全细胞膜片钳技术,记录低渗液灌流心肌细胞后ICl,Vol电流的特征及两种氯通道阻断剂DIDS和DCPIB对该电流的影响。3.应用全细胞膜片钳技术,记录含STS的等渗液灌流心肌细胞后氯电流的特征及两种氯通道阻断剂DIDS和DCPIB对该电流的影响。4. PI3K/Akt信号分子特异性抑制剂LY294002及其激动剂Insulin预处理30min后,进行全细胞膜片钳记录,方法同上,观察二者对STS诱导氯电流产生的影响。研究结果:1.实验结果证实在220毫渗单位(Osmol/kgH2O)低渗液灌流心肌细胞可产生ICl,Vol电流,当去极化电压达到+80mV时即出现时间依赖性失活,+100mV时的电流密度为19.45±1.76 pA/pF(n=5),在+40mV,+60mV,+80mV及+100mV时均可被DIDS和DCPIB呈电压依赖性阻断,I/V曲线图显示该电流呈现外向整流性。2.首次在心肌细胞膜记录到STS(4μmol/L)诱导产生的氯电流,呈现类似ICl,Vol电流的电生理学特性:外向整流性、高正电压处呈现时间依赖性失活、氯通道阻断剂的敏感性,符合ICl,Vol电流的特征。+100mV时的电流密度为18.73±2.32 pA/pF(n=5,P>0.05,STS组vs.低渗组),应用DIDS(500μmol/L)和DCPIB(10μmol/L)能够显著地抑制该氯电流的产生,在+100mv时,二者对STS诱导氯电流的抑制率分别为92.6%±7.3%(n=5,P<0.01,STS+DIDS组vs.STS组)和78.4%±5.5%(n=5,P<0.01,STS+DCPIB组vs.STS组),且二者存在明显差异(n=5,P<0.01,STS+DIDS组vs.STS+DCPIB组),支持该氯电流是以ICl,Vol电流为主的氯电流。3. PI3K/Akt信号分子的特异性抑制剂LY294002(20μmol/L)易化了STS诱导ICl,Vol电流的产生,+100mV时的电流密度为19.54±2.70 pA/pF(n=5,P>0.05,STS+LY294002组vs.STS组),但较单纯STS诱导的电流时间显著缩短(n=5,P<0.01,STS+LY294002组vs.STS组);PI3K/Akt信号分子的激动剂Insuli(n100nmol/L)则抑制了STS诱导ICl,Vol电流的产生,+100mV时的电流密度为15.40±2.13 pA/pF(n=6,P<0.01, STS+Insulin组vs.STS组和STS+LY294002组),提示PI3K/Akt信号分子参与了STS诱导ICl,Vol电流的调控。结论:1.低渗可以诱导心肌细胞产生ICl,Vol电流,即呈现外向整流性,高正电压处呈时间依赖性失活,可被氯通道阻断剂DIDS和DCPIB所阻断。2. STS也可以诱导心肌细胞产生类似ICl,Vol电流,其电生理学特性符合ICl,Vol电流。3.应用PI3K/Akt信号分子的特异性抑制剂LY294002,及其激动剂Insulin后,分别易化和抑制了ICl,Vol电流的产生,支持PI3K/Akt信号分子参与了STS诱导ICl,Vol电流的调控。
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