论文部分内容阅读
人源MIP18（MMS19-interacting protein of18 kDa）由163个氨基酸组成，分子量为18KD，定位于染色体16q22.1-q22.3。到目前为止，有关MIP18的报道甚少，该蛋白质在生物体内高度保守，其功能尚未完全明确。有研究报道MIP18能够与DNA修复基因MMS19,铁硫蛋白CIAO1组成一个复合物，协助铁硫簇嵌插进入脱辅基蛋白，从而参与DNA新陈代谢和基因稳定性相关铁硫蛋白的合成。过表达MIP18能够减少内皮细胞转录因子E2-2的表达，因而能促进内皮细胞增殖、迁移和管腔形成；MIP18能够与DNA修复基因MMS19、XPD，ANT2形成一个复合物，即MMXD，该蛋白复合物能够调控染色体的分离，沉默MIP18的表达会使染色体不能正常分离，从而导致异常形状细胞核的聚集。综上所述，MIP18在细胞新陈代谢、DNA修复、染色体分离、肿瘤的形成过程中可能发挥重要作用。凋亡素（Apoptin)是由鸡贫血病毒编码产生的一种小分子功能蛋白，由121个氨基酸组成。由于它能够特异性诱导多种肿瘤细胞和转化细胞凋亡而对正常细胞无杀伤作用，因而被称作凋亡素。有研究表明细胞核定位是Apoptin特异性诱导肿瘤细胞凋亡的关键因素。本课题组前期研究结果发现并证实：MIP18在肿瘤细胞和正常细胞中存在表达差异，在肝癌细胞HepG2中表达量明显低于肝正常细胞L02，在肝癌与肺癌组织中的表达量明显低于癌旁正常组织；MIP18是能与Apoptin相互作用的蛋白质，并且这种相互作用在正常细胞和肿瘤细胞中均存在。由于蛋白质的功能与其相互作用蛋白质密切相关，这提示MIP18可能在Apoptin的肿瘤特异性诱导凋亡效应中发挥作用，因此我们拟探讨MIP18可能通过影响Apoptin在正常细胞和肿瘤细胞中的定位而导致Apoptin特异性诱导肿瘤细胞凋亡。 目的：①宫颈癌细胞HeLa中过表达MIP18后，研究过表达MIP18对Apoptin的亚细胞定位及诱导凋亡效应的影响；②肝正常细胞L02中沉默MIP18的表达后，研究沉默MIP18对Apoptin的亚细胞定位及诱导凋亡效应的影响。 方法：通过脂质体转染的方法将pcDNA3.1-myc-mip18和pcDNA3.1-flag-apoptin真核表达载体共转染HeLa细胞，检测MIP18和Apoptin能否成功表达；再通过免疫荧光技术观察Apoptin在HeLa细胞中的亚细胞定位；应用噻唑兰(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)分析法检测过表达MIP18后Apoptin对HeLa细胞增殖率的影响；运用流式细胞术检测过表达MIP18后Apoptin对HeLa细胞诱导凋亡活性的影响。从吉凯生物公司订购能够沉默MIP18表达的shRNA，在mRNA和蛋白水平检测MIP18 shRNA沉默效果；将MIP18 shRNA和表达Apoptin的质粒共转染L02细胞后，运用同样的方法研究MIP18沉默后，是否改变Apoptin在L02细胞中的亚细胞定位、增殖率及凋亡率。 结果：①pcDNA3.1-myc-mip18和pcDNA3.1-flag-apoptin真核表达载体转染到HeLa细胞后均能够成功表达；免疫荧光结果显示HeLa细胞中过表达MIP18后，MIP18能使定位于细胞核的Apoptin重新定位于细胞质；MTT结果表明Apoptin对过表达MIP18的HeLa细胞增殖率抑制作用减弱；流式细胞术结果表明Apoptin对过表达MIP18的HeLa细胞诱导凋亡效应减弱。②由吉凯生物公司订购的MIP18 shRNA3600，3601在肝正常细胞中对MIP18均有沉默效果，3600效果更佳；MIP18 shRNA与Apoptin共转染L02细胞均能够成功表达；免疫荧光结果显示沉默MIP18后对Apoptin在L02细胞中的亚细胞定位没有影响，均定位于细胞质；MTT或流式细胞术结果表明Apoptin对沉默MIP18表达的L02细胞增殖率抑制作用及诱导凋亡效应没有明显增强。 结论：⑴在宫颈癌细胞HeLa中共转染表达MIP18和Apoptin的质粒，过表达的MIP18能够使Apoptin由细胞核重新分布于细胞质，从而降低Apoptin对肿瘤细胞HeLa的特异性诱导凋亡效应，MIP18可能是影响Apoptin进入细胞质的蛋白。⑵在肝正常细胞L02中共转染表达MIP18 shRNA和Apoptin质粒，观察到MIP18表达降低后，未改变Apoptin在正常细胞中的细胞质定位，也未改变Apoptin对正常细胞的诱导凋亡效应，MIP18并不是影响 Apoptin进入细胞质的唯一因素，Apoptin由细胞质转移到细胞核可能还受到其他因素的共同调节。