研究背景和目的:近年来,肿瘤的发生率和死亡率持续升高,已成为中国患者的疾病死因之首和一个重要的公共健康问题,而我国作为乙肝大国,每年有超过10万人死于原发性肝癌。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌中最常见的类型,在全球范围内,肝细胞癌是第六大最常见的肿瘤,在肿瘤相关死因中排名第三,仅次于肺癌和胃癌。肝癌的主要治疗手段为手术治疗,放化疗效果较差。而同大部分肿瘤一样,肝细胞癌的早期诊断和手术的比例仅10%～20%,大多数患者在诊断时已是晚期或终末期,治疗手段有限且预后较差。肝癌可能由多种因素共同作用,通过多种途径引起,具体的发病机制尚不清楚。NCOA5(Nuclear receptor coactivator 5),也称为 CIA(coactivator independent of AF-2 function),是一种不依赖于 AF2(activation function 2)的共激活因子,可以调节ERα的转录。前期研究发现,NCOA5在原发性肝癌和糖尿病的发生发展中具有重要的作用,NCOA5表达缺陷不仅分别是Ⅱ型糖尿病(T2D)和HCC的致病原因,也是联系T2D和HCC的重要因素。NCOA5在食管癌、胃癌、结直肠癌等肿瘤中也起着重要的作用,但其具体的作用机制尚不清楚。有研究显示,NCOA5对维持多能干细胞的自我更新具有重要作用。因此,本研究的目的是明确NCOA5在肝细胞癌中的重要功能及作用机制,为研究肝细胞癌的发生发展提供分子机制,同时为肝细胞癌的治疗寻找可能的靶点。方法:1.以人肝癌细胞系 HuH-7,HepG2,Bel-7402,Bel-7404,HCCLM3,SK-Hep-1及人永生化肝上皮细胞L02为研究对象,使用蛋白质免疫印迹实验明确各肝癌细胞及肝上皮细胞中NCOA5蛋白的表达情况。2.以NCOA5高表达的肝癌细胞株HCCLM3为研究对象,利用CRISPR/Cas9技术对HCCLM3细胞中的NCOA5进行基因敲除,经过蛋白质免疫印迹及基因组测序验证,证明敲除成功。3.根据CRISPR在线设计工具对实验中使用的sgRNA序列进行评估及潜在脱靶位点预测和测序验证。4.选取利用 CRISPR/Cas9 成功敲除 NCOA5 的 NCOA5-KO-1,NCOA5-KO-2细胞及野生型细胞株WT,分为三组,分别检测NCOA5基因敲除对肝癌细胞的增殖、迁移和肿瘤球形成能力的影响。5.选取利用CRISPR/Cas9敲除NCOA5效率最高的NCOA5-KO-1细胞及对照的WT,进行转录组测序(RNA-seq),寻找差异表达基因并进行聚类分析。6.将NCOA5敲除成功的NCOA5-KO-1,NCOA5-KO-2细胞及对照细胞WT,分为三组,提取细胞总蛋白后,使用蛋白质免疫印迹实验检测与细胞上皮间充质转化(EMT)和肿瘤干细胞相关蛋白的表达情况。7.统计学分析:应用SPSS 13.0进行统计学处理,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。两组及多组间均数的比较采用独立样本t检验和单向方差分析;多重比较时,方差齐性用LSD法,方差不齐用Dunnett法。P<0.05(双侧)有统计学意义。结果:使用CRISPR/Cas9技术对HCCLM3细胞中NCOA5进行基因编辑,经过基因组测序及蛋白质免疫印迹实验证明NCOA5敲除成功,并在预测的潜在脱靶位点未发现突变,证明敲除NCOA5成功且在预测的潜在脱靶位点处未出现脱靶现象。细胞功能实验显示,敲除NCOA5后,HCCLM3细胞的增殖速度显著减慢,迁移能力下降,肿瘤球形成能力下降。转录组测序(RNA-seq)发现,敲除NCOA5后,有1335个基因的表达发生变化,其中602个基因的表达上调,733个基因表达下调。聚类分析结果显示差异表达基因与细胞粘附、细胞基质合成、细胞代谢等相关;同时发现,在HCCLM3细胞中敲除NCOA5后,抑制了细胞上皮间充质转化(EMT)及肝癌干细胞相关的基因的表达。进一步的实验显示,敲除NCOA5抑制了细胞的EMT和干性相关基因的表达。结论:使用CRISPR/Cas9技术敲除HCCLM3细胞中NCOA5基因,为研究NCOA5在肝细胞癌中的作用提供了重要的细胞模型;在肝癌细胞中敲除NCOA5可能通过抑制EMT进而抑制肝癌干细胞的形成,进而抑制肝癌细胞的增殖、转移和肿瘤干细胞的形成。