论文部分内容阅读
目的：探讨无血清环境下联合应用bFGF、PDGF、Ra、HRG、Forskolin对大鼠神经干细胞诱导分化的作用。方法：用无血清培养技术从14-16天孕龄胚鼠脑中分离、培养神经干细胞；用免疫细胞化学方法对神经干细胞进行鉴定，并通过流式细胞仪检测神经干细胞的增殖能力；用传2-3代的神经干细胞接种于多聚赖氨酸包被的玻片，分以下四组，分别为两步法组、一步法组、血清组和神经干细胞培养组(bFGF组)；通过免疫细胞化学技术，用Map2和S100抗体鉴定分化的细胞；通过图像分析系统来测量神经元样细胞的最长突起长度、胞体周长、胞体面积，神经元细胞计数并计算各组Map2阳性的细胞比例。用全细胞膜片钳技术记录分化后细胞的钠电流；并且用统计分析软件对数据进行统计分析。结果：1、神经干细胞的分离、培养、观察和鉴定：从孕14—15天的胎鼠大脑皮层分离的细胞呈圆形，折光性好；培养6—7天后可以传代，细胞球边界清晰，折光性好，立体感强；免疫细胞化学方法鉴定细胞球内有较多Nestin阳性细胞。流式细胞仪检测各代细胞球内均有较多细胞处于G1／M和S期。2．神经干细胞的诱导分化：Map2的免疫荧光技术显示一步法组Map2阳性神经元样细胞的比例最高，为43.35±13.75μm，且一步法诱导出的神经元样细胞中有相当多细胞表达TH阳性。图像分析结果显示：一步法组与两步法组细胞胞体较大，胞体面积分别为136.22±33.08μm~2、131.45±24.58μm~2，胞体周长分别为48.63±5.5μm、49.3±7.71μm，细胞突起长，最长突起分别为123.63±31.48μm、116.51±38.34μm。统计结果显示：①Map2阳性神经元样细胞所占比例：一步法组与血清组有显著差异(P＜0.05)，其它各组之间没有显著差异。②胞体面积及周长：一步法组与两步法组之间没有显著差异，但它们和其余各组之间都有显著差异。③突起的长度：一步法组与血清组、bFGF组有显著差异，与两步法组之间没有显著差异：两步法组与bFGF组有显著差异。电生理检测显示：一步法组中大部分形态成熟的神经元样细胞(80％)能诱发电压依赖性的Na~+通道电流，两步法仅有少量细胞(20％)能诱发电压依赖性的Na~+通道电流，而未分化细胞及其它两组细胞均未记录到内向电流。结论：1．培养的原代及传代后的大鼠胚胎皮层NSCs表达Nestin，并具有自我更新和多向分化的能力。2．在体外无血清条件下联合应用bFGF、PDGF、RA、HRG、Forskolin对大鼠NSCs向神经元定向诱导分化是可行的，能促进NSCs分化成神经元。3．在体外无血清条件下，联合应用5种因子的一步法和分两步进行诱导的两步法相比，一步法既能促进NSCs分化成更多的神经元，也可促进分化后神经元的成熟