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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是危害养猪业发展的重要传染病之一。2006年首次在我国爆发了高致病性PRRS(Highly Pathogenic-PRRS,HP-PRRS),其发病率和死亡率与经典的PRRS比较都显著升高。PRRSV具有严格的细胞嗜性,其靶细胞为肺泡巨噬细胞(Pulmonary alveolar macrophage,PAM)。PRRSV感染PAM效率的高低与其毒力有关,毒力越强,感染效率越高。本实验室前期实验结果也证明,HP-PRRSV HuN4毒株感染PAM的效率明显高于弱毒株HuN4-F112。本实验通过分析PRRSV强弱毒感染PAM后膜蛋白的差异表达情况,探究差异表达的膜蛋白对PRRSV感染和复制的影响及其作用机制,以期阐明引起PRRSV强弱毒感染PAM效率差异的机制,探寻HP-PRRSV高发病率和高死亡率的致病机理。本实验首先通过流式细胞术对带有EGFP标记的HP-PRRSV毒株HuN4(rHuN4-EGFP)及其体外传代致弱毒株HuN4-F112(rHuN4-F112-EGFP)感染的PAM进行分选,然后通过shotgun质谱技术对感染PRRSV强弱毒的PAM进行差异膜蛋白分析。以1MOI的rHuN4-EGFP和rHuN4-F112-EGFP分别感染PAM,24h后通过流式细胞术FITC通道收集被PRRSV感染的PAM,分别提取感染组与未感染组膜蛋白进行shotgun质谱分析,筛选到82个在强弱毒感染的PAM间存在差异表达的膜蛋白。感染rHuN4-EGFP的样品与未感染样品相比,有72个蛋白特异表达;感染rHuN4-F112-EGFP样品与未感染样品相比,有12个蛋白特异表达。通过GO分析发现,这些蛋白主要参与代谢、生物调节、细胞加工过程,大多数蛋白具有结合、催化活性。在MARC-145细胞上过表达部分差异膜蛋白,Western Blot结果表明差异膜蛋白PCSK9能明显抑制PRRSV强毒株和弱毒株的复制,Clusterin、Apoliprotein C-II能促进PRRSV强毒株复制。在MARC-145细胞上过表达PCSK9,再感染PRRSV,IFA、RT-qPCR、多步生长曲线结果均显示PCSK9能显著抑制PRRSV复制,且PCSK9对HP-PRRSV HuN4强毒株的抑制程度明显高于弱毒株HuN4-F112。PCSK9不仅能抑制北美型PRRSV复制,对欧洲型PRRSV代表毒株Lelysted株也有抑制作用,PCSK9很可能是一种广谱的抑制PRRSV复制的因子。通过RT-qPCR检测发现PCSK9对病毒的吸附和进入过程没有影响,其对PRRSV的抑制作用主要发生在病毒进入细胞后的生物合成阶段。另外,进一步研究发现内源性PCSK9的mRNA水平与PRRSV的感染剂量、感染时间有相关性。在病毒感染早期,能刺激PCSK9 mRNA的表达,而随着感染时间的延长、病毒量的增加,PCSK9 mRNA水平开始下降,且PCSK9蛋白的成熟以及PCSK9抗病毒作用与泛素蛋白酶体降解途径有关。另一方面,PRRSV也能通过泛素蛋白酶体途径降解PCSK9蛋白,拮抗PCSK9的作用。同时,本研究通过免疫共沉淀实验证明PCSK9可与胆固醇代谢相关的受体LDLR互作,LDLR也能抑制PRRSV复制;另外,研究发现PCSK9能够与PRRSV受体CD163共定位及互作,且初步研究结果表明PCSK9能够通过泛素蛋白酶体途径降解PRRSV受体CD163,从而抑制PRRSV复制。综上所述,本研究利用Shotgun质谱技术成功筛选到对PRRSV复制具有影响的差异膜蛋白,并对PCSK9抑制PRRSV复制的作用机制进行了深入研究,为深入了解PRRSV复制特性及PRRSV的致病机制奠定了基础。