论文部分内容阅读
恶性肿瘤是一类严重危害人类身心健康的疾病，是全球疾病致死的重要原因。过继T细胞免疫治疗是一种新的肿瘤治疗方法，己成为国内外的研究热点，这种过继免疫治疗对肿瘤有一定疗效，但是由于T细胞的靶向性不好，导致体内治疗效果不佳。因此，如何增强T细胞的活性，提高抗肿瘤疗效是必须攻克的难题。 目的:利用hEnd-Apt与肝癌细胞的特异性结合及CD3单克隆抗体与PD-1-T细胞的特异性结合的特性，将hEnd-Apt与CD3单克隆抗体偶联到同一纳米脂质体上，形成hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物，并利用该纳米复合物修饰的PD-1-T细胞过继治疗以实现靶向抗肿瘤效应。 方法:采用薄膜水化法制备纳米脂质体，然后利用核酸适配体人Endoglin适配体(bEnd-Apt)和人CD3单克隆抗体(CD3Ab)修饰于脂质体表面，即利用纳米脂质体表面的马来酰亚胺基团与标记有巯基(-SH)的适配体hEnd-Apt及经过二硫苏糖醇(DTT)还原为带巯基的人CD3单克隆抗体发生迈克尔加成反应，把适配体及抗体修饰到纳米脂质体的磷脂双分子层表面，成功构建hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物。使用动态光散射仪(Dynamic Light Scattering Instrument，DLS)测定制备纳米复合物的粒径大小以及电位变化，并使用透射显微镜观察所制备纳米复合物的粒径大小及形态。通过CCK-8实验及纳米复合物处理后的小鼠主要组织器官HE染色实验考察hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物对细胞和组织的毒性。通过流式细胞术检测hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物与PD-1-T细胞和靶细胞HepG2细胞的结合情况。通过荧光共聚焦显微镜观察该纳米复合物与靶细胞HepG2细胞及对照细胞A549细胞的结合情况。使用流式细胞术检测在相应靶细胞刺激下hEnd-Apt/CD3-Lipo复合物修饰的PD-1-T细胞表达CD25和CD69的情况。通过ELISA方法检测在相应靶细胞存在情况下hEnd-Apt/CD3-Lipo复合物修饰修饰的PD-1-T细胞分泌细胞因子IL-2、IFN-γ的水平。流式细胞术检测hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物修饰的PD-1-T细胞对靶细胞的特异性杀伤效应。将hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物修饰的PD-1-T细胞过继到荷人肝癌SCID鼠，考察该纳米复合物在体内的抗肿瘤效应。 结果:透射电镜图像结果显示hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物大小在100nm以内。CCK-8实验及HE染色实验显示该复合物对细胞和主要组织脏器均无毒性。流式细胞术检测结果显示hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物能与PD-1-T细胞和靶细胞HepG2细胞结合。在相应靶细胞刺激下，与其他对照纳米复合物组比较，hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物修饰的PD-1-T细胞表达CD25和CD69的水平升高，分泌细胞因子IL-2、IFN-γ的水平提高。hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物修饰的PD-1-T细胞对靶细胞HepG2细胞的杀伤实验结果显示该纳米复合物修饰的PD-1-T细胞在体外具有特异性杀伤靶细胞的效应。hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物修饰的PD-1-T细胞靶向治疗荷人肝癌SCID鼠的实验结果证明该纳米复合物修饰的PD-1-T细胞在治疗荷瘤小鼠后能够延长小鼠生存时间，抑制小鼠肿瘤生长。 结论:hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物修饰的PD-1-T细胞具有靶向抗肿瘤的效应，为肿瘤的免疫治疗提供一种新的技术手段和方法，具有潜在的临床应用前景。