乳腺癌是女性恶性肿瘤中最常见的肿瘤之一,约占所有女性肿瘤发生的第二位。对于乳腺导管内癌患者而言,有无合并浸润癌的存在不仅直接影响到治疗方法及预后,且对患者的心理及生活状态产生巨大影响。然而在实际工作中,判断导管内癌有无合并浸润,尤其是早期浸润,往往十分困难,早期浸润主要包括直径不超过1mm的微浸润癌和直径1-2mm的浸润癌。乳腺早期浸润癌经常在高级别导管原位癌的背景下发生,少数情况下会伴发其他类型导管原位癌和小叶原位癌。世界卫生组织(WHO)在乳腺肿瘤的分类中,对于乳腺微浸润癌的定义是“在乳腺间质中,出现一个或多个独立的显微镜下的浸润灶为特征,并且每一个浸润灶的大小均不超过1mm”。由于癌灶过小,乳腺微浸润癌的诊断对于病理学家来讲仍然是很大的挑战:乳腺导管原位癌周围的纤维化,炎性反应和其他间质病变都有可能导致误诊为微浸润癌,另外一方面,在间质中的微浸润癌团块也很容易被忽略而导致漏诊。同样,对于直径1-2mm的乳腺早期浸润癌也会遇到这样的问题而增加诊断难度。组织病理学上,乳腺浸润癌的标志是癌灶周围肌上皮细胞层的缺失。免疫组化法对于乳腺早期浸润癌的病理诊断过程是一项极其重要的辅助手段,目前有多种用来检测肌上皮细胞层的抗体标记物,其中最常用的标记物有SMM-HC,Calponin和p63。然而,针对肌上皮的免疫组化单项标记,仍然不能确定间质中一些缺乏肌上皮细胞层的微小细胞团是否为癌细胞团(可表达上皮标记)或者仅仅是增生的成纤维细胞和组织细胞(不表达上皮标记)。免疫组化双染法是一种可以在组织中同时标记两类不同抗原的方法,每类抗原可以由一到两种抗体(显示同种颜色)标记,而两类抗原显示两种不同的颜色,从而在同一组织中的不同细胞类型中表达,由于免疫组化双染法的此种特性,同时双染肌上皮细胞层和上皮细胞层可对乳腺早期浸润癌的诊断提供帮助。本研究通过将乳腺特异性肌上皮细胞标记物(calponin和p63蛋白)和腺上皮细胞标记物(e-cadherin和ck7)搭配,在乳腺组织中进行免疫组化单染,两抗体双染和三抗体双染,并进行鸡尾酒法和顺序性双染法的比较,确定一组最优的组合和最优方法,之后将此组合和方法应用于下述实验中进行验证,检测在病理诊断中对有无浸润癌诊断困难的乳腺癌病例和高级别导管原位癌组织间质中的早期浸润癌的发生情况,从而尝试寻找一组适合推广到常规临床病理诊断中的免疫组化双染法及可搭配组合。目的通过分析对比免疫组化单染法(p63和calponin)、两抗体鸡尾酒双染法(p63+ck7和calponin+e-cadherin)、三抗体鸡尾酒双染法(calponin/p63+e-cadherin和calponin/p63+ck7)和三抗体顺序性双染法(calponin/p63+e-cadherin和calponin/p63+ck7)在正常乳腺组织中的表达效果,筛选出本研究中可在乳腺组织中应用的最优组合和最优方法。研究筛选出的最优组合和最优方法是否可以提高乳腺早期浸润癌病例的确诊率。研究高级别乳腺导管原位癌组织中早期浸润癌的发生情况。方法1.(1)利用免疫组化单染maxvision二步法检测18例正常乳腺组织中p63和calponin两种蛋白在乳腺肌上皮细胞的表达情况;(2)利用两抗体鸡尾酒双染法检测calponin+e-cadherin和p63+ck7两组抗体在正常乳腺组织的肌上皮和腺上皮细胞中的表达情况;(3)利用三抗体鸡尾酒双染法和三抗体顺序性双染法检测calponin/p63+e-cadherin和calponin/p63+ck7在乳腺正常组织肌上皮细胞层和腺上皮细胞中的表达情况。2.在临床病例中,选取34例在病理诊断中对有无早期浸润癌诊断困难的乳腺癌病例(包括病理诊断标明为可疑浸润或参加会诊后才确定浸润的病例),应用上一阶段筛选出的最优组合及方法进行检测。3.应用第一阶段筛选出的最优组合及方法检测29例乳腺高级别导管原位癌的部分组织中是否有早期浸润癌情况的发生。结果1.正常乳腺组织的检测结果显示,在肌上皮细胞层的染色强度上,三抗体鸡尾酒双染法优于三抗体顺次性双染法(p<0.05),并且优于单染法(p<0.05)和两抗体鸡尾酒双染法(p<0.05)。综合评分系统对肌上皮细胞层和腺上皮细胞层抗体表达情况的综合得分显示,calponin/p63+e-cadherin三抗体鸡尾酒双染法和三抗体顺序性双染法对于乳腺导管的肌上皮和腺上皮细胞层的染色得分的差别没有统计学意义(p>0.05),而calponin/p63+ck7三抗体鸡尾酒双染法优于三抗体顺序性双染法(p<0.05)。通过正常乳腺显微镜下图像的染色效果结合综合评分判断,显示calponin/p63+e-cadherin三抗体鸡尾酒双染法是染色效果的最优选择。2.通过应用calponin/p63+e-cadherin三抗体鸡尾酒双染法对有无早期浸润癌诊断困难病例检测结果显示,21例有明确浸润癌,含2例(5.89%)局灶片状浸润,5例(14.71%)浸润范围>1mm的浸润癌,14例(41.18%)微浸润癌(≤1mm),确诊率提高。3.通过应用calponin/p63+e-cadherin三抗体鸡尾酒双染法对乳腺高级别导管原位癌的部分组织检测结果显示,有4例(13.79%)可发现微浸润癌组织(≤1mm)。结论1.在乳腺组织中,三抗体鸡尾酒双染(calponin/p63+e-cadherin)法在提高肌上皮细胞显色的特异性和敏感度的同时,与导管腺上皮细胞显色形成鲜明对比,易于观察,是这项研究中同时检测乳腺组织腺上皮及肌上皮的最优组合及方法。2.三抗体鸡尾酒双染(calponin/p63+e-cadherin)法可提高乳腺早期浸润癌的确诊率及诊断效率,具有一定的临床病理应用价值。