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目的:大鼠牙囊细胞（Rat dental follicle cells,rDFCs）是牙周组织的前体细胞。骨形态发生蛋白9（Bone morphogenetic protein 9,BMP9）在细胞增殖分化过程中起重要作用。肿瘤坏死因子-alpha（Tumor necrosis factor-alpha,TNF-alpha）是重要炎症因子之一,也是骨吸收的重要因素。Wnt信号通路参与了体内许多组织的发育和新陈代谢。Wnt经典信号通路可以被Dickkopf相关蛋白1（Dickkopf related protein 1,DKK1）抑制。本次研究旨在探索炎症因子TNF-alpha和Wnt经典信号通路抑制剂DKK1对BMP9转染的大鼠牙囊细胞成骨和相关通路的影响。方法:从大鼠的下颌骨中提取牙囊组织。牙囊细胞在完全培养基中培养,用表达BMP9的重组腺病毒转染牙囊细胞。将第三代健康的牙囊细胞接种到96孔板中。培养24小时后细胞贴壁,用含有不同浓度的TNF-alpha或DKK1培养基培养。第1、3、5和7天后,在450nm波长下测量的光密度值（optical density,OD）,计算细胞增殖活性。含TNF-alpha和DKK1的培养基培养BMP9转染的牙囊细胞。用碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性检测,碱性磷酸酶染色,茜素红染色来评估对牙囊细胞成骨的影响,同时检测牙囊细胞中成骨基因的表达。Western blot和RT-qPCR检测Wnt信号通路和Smad信号通路中关键基因的表达。结果:培养10小时后,牙囊细胞以单细胞层的形式附着在培养皿表面。72小时后,牙囊细胞呈梭形或多边形。用携带BMP9的腺病毒转染,以仅携带绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）的腺病毒为载体对照组,24小时后在牙囊细胞中可以检测到绿色荧光的表达,尤其是在核周围区域。与对照组相比,高浓度的TNF-alpha（50 ng/mL）在第5天和第7天降低了牙囊细胞的增殖活性。浓度为0.8 ng/mL的DKK1也会抑制牙囊细胞的增殖,而其他浓度则不影响牙囊细胞的增殖。因此选择10ng/mL TNF-alpha和0.4 ng/mL DKK1作为刺激浓度,用于后续实验。BMP9转染的牙囊细胞用TNF-alpha和DKK1处理,处理后7和14天收集细胞,ALP活性检测,ALP染色,茜素红染色观察细胞成骨效果:TNF-alpha和DKK1抑制BMP9转染的牙囊细胞的成骨作用,但DKK1促进TNF-alpha/BMP9诱导的成骨作用。用RT-qPCR检测成骨基因的表达,也观察到了类似的结果:TNF-alpha或DKK1下调了ALP,骨钙蛋白（Osteocalcin,OCN）和Runt相关转录因子（Runt-related transcription factor,RUNX2）的表达,而DKK1上调了TNF-alpha/BMP9中的ALP,OCN和RUNX2的表达。TNF-alpha上调beta-连环蛋白（beta-catenin）的表达,下调了糖元合成酶激酶-3beta（Glycogen synthase kinase-3beta,GSK-3beta）、钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II(Ca2+/calmodulin dependent protein kinase II,CaMKII)和Nemo样激酶（Nemo-like kinase,NLK）的表达,提示激活了Wnt经典信号通路,抑制了Wnt非经典信号通路。DKK1的效果与其相反,抑制了beta-catenin的表达,促进了GSK-3beta CaMKII、NLK的表达,提示Wnt经典信号通路被抑制,非经典信号通路被激活。TNF-alpha和DKK1能抑制BMP-Smad途径,降低磷酸化Smad1/5/8（Phosphorylation Smad1/5/8,P-Smad1/5/8）的表达。但是,DKK1和TNF-alpha联合使用时,上述抑制作用减弱。结论:TNF-alpha降低BMP9的成骨活性。DKK1降低了TNF-alpha对BMP9的成骨抑制作用,可能是通过影响Wnt信号通路和Smad信号通路来发挥作用的。因此,结果提示DKK1和BMP9的联合使用可能是研究牙周炎骨缺损治疗的不错方向,但需要动物实验做进一步的验证。单独使用DKK1会抑制BMP9诱导的成骨作用。完全解释其中机制从而定义治疗炎症相关的牙槽骨缺损的新方法需要进一步的研究。