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背景阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）是老年期最常见的一种痴呆类型,其主要病理特征是β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）沉积构成的老年斑和Tau蛋白过度磷酸化形成的神经元纤维缠结。已有研究表明,在AD患者脑内糖原合成激酶-3β（Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）蛋白活性的升高与该两大病理特征密切相关,而降低GSK-3β活性,则可减轻AD的病理状态。CRISPR/Cas9基因编辑技术为修复基因功能失调提供了强有力的手段,而基因靶向治疗的关键是找到合适的基因载体并靶向到目标区域,但脑部疾病由于血脑屏障（Blood-brainbarrier,BBB）的存在使治疗更加困难,以往的研究表明,超声（Ultrasound,US）联合微泡（Microbubbles,MBs）可有效地开放BBB,但血管内MBs空化因无法接触神经细胞而难以对其产生声孔效应,因此,本研究提出一种二次超声空化在体靶向基因编辑GSK-3β治疗AD的方法,拟用超声联合MBs空化开放靶区BBB,再注射载腺相关病毒CRISPR/Cas9（Adeno-Associated Virus CRISPR/Cas9,A-C）的生物纳泡（Biosynthetic nanobubbles,BNBs）,其借助开放的BBB进入脑组织直接接触神经细胞,再利用超声诱发BNBs产生空化,使细胞膜开孔高效递送编辑系统,实现在体靶向基因编辑。本研究将进一步探讨利用二次超声空化在体靶向基因编辑治疗AD效果及机制,为超声靶向基因编辑治疗AD提供新思路。目的在超声联合MBs打开BBB后,本研究提出一种二次超声联合BNBs在体基因编辑GSK-3β治疗AD的方法,使细胞膜开孔高效递送CRISPR/Cas9基因编辑系统,实现在体靶向基因编辑,从而敲减GSK-3β对Aβ1-42寡聚体诱导的AD样小鼠的治疗作用,为超声靶向基因编辑治疗AD提供新思路。方法1.通过在ATCC培养基中培养嗜盐菌（Halobacterium NRC-1,Halo）提取生物合成的纳米泡BNBs,使用马尔文粒径电位仪、电镜和超声仪测量BNBs的粒径、电位、形态和超声造影成像表征;将阳离子聚合物PEI偶联到BNBs的外壳上,得到表面带有正电荷的BNBs（Cationic BNBs,CBNBs）,用马尔文粒径电位仪检测CBNBs的粒径、电位表征、琼脂糖凝胶电泳检测CBNBs携载质粒的能力。2.老化后的Aβ1-42寡聚体孵育N2a细胞24h,将纳泡转染复合物（CBNBs-AAV-CRISPR/Cas9,CBNBs-A-C）加到细胞中,在超声作用下进行转染,通过Western Blot检测与Tau磷酸化有关的蛋白GSK-3β、P-GSK-3β（Ser9）以及相关Tau磷酸化位点的蛋白变化。3.用bEnd.3细胞构建体外BBB模型,观察在超声的作用下,不同微泡对体外BBB模型的开放效果。4.通过在C57小鼠双侧海马CA1区注射Aβ1-42寡聚体,构建脑内Aβ聚集的AD小鼠模型。经尾静脉注射MBs,在一次超声作用下打开BBB后,继续从尾静脉向体内输送转染复合物CBNBs-A-C,二次超声联合CBNBs-A-C增加对神经细胞的转染效率。使用水迷宫和Y迷宫检测小鼠的学习记忆能力;用Western Blot检测海马脑组织中与Tau磷酸化有关的蛋白GSK-3β、P-GSK-3β（Ser9）以及相关Tau磷酸化位点的蛋白变化;使用免疫组化评价突触素的表达量、脑片钳检测长时程增强（long-term poentiation,LTP）,从而评价小鼠的学习记忆及突触的可塑性。结果1.BNBs是一个表面带有负电荷的纳米级纺锤状气泡,并且可在体内造影成像;用PEI把BNBs改良成表面带正电荷的BNBs（CBNBs）后,没有改变BNBs粒径但却明显地逆转了其表面电位,并且CBNBs作为一个新型的基因载体,能良好地结合带负电的质粒。2.Aβ1-42寡聚体能激活GSK-3β的蛋白表达量,增强Tau蛋白的磷酸化程度,在超声的作用下,转染复合物（CBNBs-A-C）可以在细胞内表达,减少GSK-3β的蛋白表达量,降低Tau磷酸化位点的蛋白表达水平。3.bEnd.3细胞可在Transwell膜上构成体外单细胞BBB模型,在超声的作用下,联合MBs对体外BBB的开放效果最好,而联合BNBs时,对体外BBB的开放效果则不明显。4.双侧海马CA1区注射Aβ1-42寡聚体激活海马区的GSK-3β,导致Tau蛋白磷酸化水平升高,诱导小鼠学习记忆水平下降。超声联合MBs打开BBB后,二次超声联合纳泡复合物（CBNBs-A-C）在体基因编辑GSK-3β基因表达,从而减少了AD样小鼠脑内的GSK-3β和相关Tau磷酸化蛋白位点的激活;提高小鼠的学习记忆能力水平;增多突触素的表达;增强海马CA1区的LTP电生理信号。结论在超声联合MBs开放BBB后,二次超声联合生物纳泡复合物作为一种新型的基因转染方法,更高效率地转染海马区的神经细胞,通过CRISPR/Cas9系统抑制GSK-3β的激活,减弱Tau蛋白的过度磷酸化和聚集,进而改善了Aβ1-42寡聚体诱导的AD模型小鼠的学习和记忆功能。