嗜线虫致病杆菌HB310菌株(Xenorhabdus nematophila HB310，Xn HB310)是本实验室从中国河北省土壤中筛选到的一株昆虫病原线虫共生细菌，前期的研究结果证实该菌株对多种农业害虫均有很高的杀虫活性。在前期的实验及基因序列检索中，发现在X.nematophila基因组序列中存在一种特殊的二元毒素基因pirAB，文献显示该毒素基因对多种昆虫具有很高的杀虫活性，具有很好的研究前景。
　　1、本研究根据GenBank上已登录的X.nematophila ATCC19061基因组信息(登录号:FN667742.1)设计引物，从Xn HB310中克隆了pirAB基因并获得pirAB全长基因序列。通过生物信息学分析可知pirA基因全长为408bp，编码135个氨基酸，蛋白理论分子量为14.9kDa;pirB基因全长为1290bp，编码429个氨基酸，蛋白质理论分子量为48.2kDa。pirA和pirB基因之间由68个碱基连接。多序列对比分析表明，pirA和pirB编码的氨基酸序列均与X.nematophila ATCC19061同源性最高，相似度达100％;pirA编码的氨基酸序列与P.luminescens相似性为51％，pirB编码的氨基酸序列与P.luminescens相似性50％。数据表明该基因核苷酸序列在不同菌属之间差异较大，但编码的氨基酸序列有一定的保守性。系统发育树的结果与氨基酸序列所属物种之间的关系一致，主要有嗜线虫致病杆菌属(Xenorhabdus)和发光杆菌属(Photorhabdus)，其他每个细菌各自形成了一个分支。
　　2、为明确PirAB蛋白的生物活性，将该毒素基因进行原核表达得到重组蛋白PirAB。纯化后的重组蛋白对5龄大蜡螟(G.mellonella)、4龄棉铃虫(H.armigera)和4龄甜菜夜蛾(S.exiguawere)进行生物活性测定，结果表明对大蜡螟(G.mellonella)、棉铃虫(H.armigera)和甜菜夜蛾(S.exiguawere)幼虫均具有很高的血腔注射活性，LD50分别为1.565μg/头、2.003μg/头和2.170μg/头。将重组蛋白对大蜡螟(G.mellonella)进行血腔注射后，虫体注射部位黑化，试虫死亡后虫尸脱水变软，寄主昆虫的血淋巴及血细胞遭受到严重的破坏。进而测定了毒素对寄主体内乙酰胆碱酯酶、解毒酶和保护酶活性的影响，结果表明PirAB蛋白注射后大蜡螟体内乙酰胆碱酯酶活性被抑制;羧酸酯酶活性被激活然后被抑制，并再次被激活，但活性持续低于对照组;多酚氧化酶活性在毒素诱导之后同样被抑制;过氧化物酶活性在毒素诱导后明显高于对照组;酪氨酸酶的活性则持续处于抑制状态。
　　3、在了解PirAB蛋白的杀虫特性及对昆虫体内酶活的影响后，为了进一步明确其致病机理，通过His-Pull down和Ligand blotting筛选大蜡螟体内与PirAB蛋白发生作用的互作蛋白。2种方法均从虫体组织中筛选出一种芳香基贮存蛋白(Arylphorin)，对大蜡螟芳香基贮存蛋白进行克隆和生物信息学分析，结果显示芳香基贮存蛋白基因全长为2109bp，由3个结构域组成，其中结构域Hemocyanin-C具有免疫和识别功能(本文暂名为Ary-C)。以芳香基贮存蛋白Ary-C结构域为研究对象，通过酵母双杂交技术分别验证PirA和PirB蛋白与Ary-C的互作关系。结果证实PirA蛋白与Ary-C具有互作反应，而PirB蛋白与之没有互作反应。确认PirAB毒素与大蜡螟芳香基贮存蛋白的互作关系对于从分子水平研究嗜线虫致病杆菌HB310菌株PirAB蛋白的作用机制具有重要意义。