目的利什曼病是由利什曼原虫无鞭毛体寄生在包括人类在内的哺乳动物巨噬细胞而引起的人兽共患寄生虫病。在我国当前流行的6省(区)中,有四省为动物源型,犬是主要传染源。对犬的管理是控制此类型黑热病的关键。因此,研究有效的快速简便适于现场使用的检测犬利什曼原虫感染的方法对控制该型黑热病具有重要意义。利什曼原虫动基体DNA (kinetoplast DNA, kDNA)是由10-20个拷贝的大环和上万拷贝的小环构成,小环序列不仅在种间,而且在种内,甚至在株内均存在高度异质性。因此,小环成为特异敏感检测利什曼原虫感染极好的靶分子。环介导等温扩增技术(1oop-mediated isothermal amplification, LAMP)具有灵敏度高、操作简单快速以及对仪器设备依赖性低的特点。本研究的目的是建立起以犬眼结膜为检测样本,以kDNA小环为检测靶分子的环介导等温扩增技术,从而为检测我国犬利什曼原虫感染提供敏感、特异、快速、简便、适合于现场应用的检测方法。方法应用来自利什曼原虫kDNA小环保守区的一对特异性引物KP1/KP2扩增我国利什曼原虫四川株小环DNA全长序列并测序,对序列进行分析；应用获得的序列在线设计多组LAMP引物,依据文献设立初始反应体系和扩增条件对每组引物的反应性进行评价,选取一组能进行敏感、特异扩增的引物应用于LAMP方法建立。应用选取的引物确定影响LAMP扩增的关键因素Mg2+和dNTPs最适浓度以优化反应体系,比较浊度法、SYBR Green法和钙黄绿素法3种观察反应结果的方法的效果,对建立的LAMP法的敏感性和特异性进行实验室评价。应用建立的LAMP方法检测现场样品(来自动物源型内脏利什曼病流行区和非流行区犬眼结膜拭子,煮沸后直接作为扩增模板),并与骨髓镜检和静脉全血常规PCR检测结果进行比较。结果应用KP1/KP2引物从汶川株利什曼原虫扩增出约850bp的动基体小环DNA序列。对随机选取的20个阳性克隆进行测序,并对序列进行了比对分析,显示这些序列可区分为两大类,其中以CQ18为代表的15个序列可归为一大类,占比75%,为优势序列,序列长度为858bp,其余以CQ07为代表的5个序列可归为一类,占比25%,序列长度为854bp,CQ18和CQ07两者序列的一致性为82.7%。进化分析显示这两类序列与杜氏利什曼原虫种团的原虫亲缘关系最近。应用CQ18序列进行在线引物设计,得到5组引物,对5组引物分别进行LAMP反应评价,只有第2组引物能引起特异、敏感LAMP反应；对反应体系进行优化,显示Mg2+最适浓度为8mM, dNTPs最适浓度为1.4mM.应用3种方法观察LAMP反应结果,显示钙黄绿素法能显著区分阳性和阴性LAMP反应结果。建立的LAMP法的检出下限为10-7个原虫/mL,而常规PCR采用RV1/RV2和K13A/K13B两对引物,检出下限分别为10-3和10-2个原虫/mL。应用其他8种不同虫种(株)的利什曼原虫kDNA进行LAMP反应,只有来自我国的3株婴儿利什曼原虫虫株JS5、甘犬和801显示阳性反应。应用建立的LAMP法、镜检法和常规PCR法检测内脏利什曼病流行区犬样本,阳性率分别为59.46%(66/111)、7.62%(8/105)和48.1%(53/110),LAMP和PCR阳性检出率无统计学差异(X2=2.83,P>0.05)。应用PCR和LAMP检测内脏利什曼病非流行区犬样本,分别出现1(1/33)和2(2/32)例假阳性,LAMP和PCR阴性检出率无统计学差异(X2=0.0007,P>0.05)。结论基于我国婴儿利什曼原虫四川汶川株动基体小环DNA序列设计引物,成功建立了以犬眼结膜组织为检测样本的检测我国犬利什曼原虫感染LAMP检测方法,与常规PCR法比较,检测的特异性相当,而检测的敏感性更高,且取样简便,反应快速,适合在现场应用。两种分子方法检测结果均显示我国动物源型黑热病疫区犬利什曼原虫感染率相当高,应加强犬的管理以控制当地的黑热病。