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第一部分基于生物信息学分析筛选钙化性主动脉瓣膜病差异表达基因和信号通路目的:钙化性主动脉瓣膜病（calcified aortic valve disease,CAVD）是全球范围内老年人患病率最高的一种心脏瓣膜病,但目前尚无药物可以延缓或阻止该疾病的进展,主要原因在于CAVD的病理机制仍没有得到清晰的研究;本研究旨在通过生物信息学方法筛选出CAVD相关的关键基因及信号通路,以为其药物治疗提供更多的靶点。方法:四个CAVD相关基因表达谱芯片（GSE12644、GSE51472、GSE77287和GSE83453）获取自基因表达数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）;使用R软件的limma程序包进行差异表达基因（differentially expression genes,DEGs）的筛选,然后基因本体功能注释（gene ontology,GO）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析利用 clusterProfiler程序包进行分析;利用STRING数据库和Cytoscape软件对蛋白质-蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction network,PPI）进行分析和可视化构建,PPI 网络的枢纽模块和关键基因分别通过Cytoscape的cytoHubba和MCODE插件进行分析获得;转录因子（transcription factor,TF）与基因的相互作用关系（TF-gene）使用ENCODE ChIP-seq数据库进行预测,然后我们使用8个数据库对靶向关键基因的微小 RNA（microRNAs,miRNAs）进行预测:miRDB、DIANA-microT-CDS、miR-map、miRTarBase、miRWalk、TarBasev8、starBase 和 TargetScanHuman 7.2,并使用Cytoscape软件对TF-gene和miRNA-gene相互作用进行可视化构建。结果:4个基因芯片共包含26个对照组和27个钙化瓣膜组织,共筛选出327个DEGs,包括206个上调基因和121个下调基因;GO功能注释分析显示免疫反应、炎症反应和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）重构等为DEGs显著富集的基因生物功能;KEGG通路富集分析结果显示这些DEGs主要富集在PI3K/AKT信号通路、NF-κB信号通路、趋化因子信号通路、补体和凝血系统、Toll样受体信号通路和白细胞内皮迁移等通路上;我们共筛选出3个关键枢纽模块;综合利用cytoHubba多种分析算法共筛选出19个关键基因:CXCL8,CXCL12,CSF1R,HCK,PLEK,CCL5,TLR8,VCAM1,CCR1,CCR7,FPR1,TYROBP,CX3CR1,KIT,PPBP,SPP1,SYK,TLR7,和VWF。miRNA-gene 作用网络结果显示 miR-141,miR-34a,miR-155和miR-486可通过调节上述关键基因参与CAVD分子机制的调控。结论:本研究通过对四个基因芯片的综合分析,共筛选出327个DEGs,其中包括206个上调基因和121个下调基因;炎症反应、ECM重构、PI3K/AKT信号通路和NF-κB信号通路等可能在CAVD分子机制中起着重要作用;本研究共筛选出19个关键基因:CXCL8,CXCL12,CSF1R,HCK,PLEK,CCL5,TLR8,VCAM1,CCR1,CCR7,FPR1,TYROBP,CX3CR1,KIT,PPBP,SPP1,SYK,TLR7,和VWF;且我们发现了多个潜在的miRNAs,包括miR-141,miR-34a,miR-155和miR-486等。本研究为发现和设计有潜力的诊断标志物和新型靶向药物提供了重要方向。第二部分二甲双胍可以通过激活PI3K/AKT信号通路的方式抑制主动脉瓣膜间质细胞的钙化目的:二甲双胍（metformin）可以通过对P13K/AKT等多种信号通路和生物过程的调控对多种疾病产生有效治疗作用,腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK）的激活是 metformin 发挥生物作用的主要机制,本研究旨在探讨metformin是否可以通过调控PI3K/AKT的方式来抑制CAVD进展。方法:9例对照组和8例钙化主动脉瓣膜组织获取自主动脉瓣膜手术患者,通过组织病理学染色对瓣膜组织进行病理改变观察,通过TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling（TUNEL）细胞凋亡检测实验检测CAVD瓣膜组织中的凋亡指数变化,并使用免疫组织化学染色（Immunohistochemical staining,IHC）对 p-AMPKα、p-AKT和BAX三种蛋白进行观察;然后,我们通过Western blot（WB）实验对瓣膜组织中PI3K/AKT信号通路、NF-κB信号通路、AMPK、p-eNOS以及凋亡通路相关蛋白进行检测。主动脉瓣膜间质细胞（aortic valve interstitial cells,AVICs）由对照组主动脉瓣膜中分离而得,细胞钙化使用磷酸盐培养基（phosphate medium,PM）进行诱导。首先,我们使用三种浓度的metformin（10 μM,100μM和1mM）进行AVICs培养,培养3天后,通过活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）检测实验和酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）实验分别检测metformin对ROS和炎症因子（IL6、IL8和MCP-1）产生的影响,通过CCK8（Cell Counting Kit-8）实验检测metformin对细胞活性的作用,并通过细胞免疫荧光（immunofluorescence staining,IF）和 WB 实验检测 metformin 对相关通路蛋白和钙化标志物（BMP2和osteopontin）进行检测;培养7天后,我们使用茜素红染色（Alizarin Red staining,ARS）检测metformin对PM诱导的钙结节形成的抑制效果。为了进一步研究metformin发挥调控作用的相关分子机制,我们使用以下几种试剂进行细胞培养:AMPK激动剂、AMPK抑制剂、NF-κB信号通路抑制剂、AKT抑制剂和siRNA;分别培养一定时间后,通过CCK8实验检测细胞的活性,通过IF和WB实验检测相关通路和AVICs成骨转化标志物（BMP2和osteopontin）的变化,使用ARS染色实验直观检测钙结节形成。最后,我们通过转录组测序进一步验证metformin在发挥抑制CAVD疾病进展中所调控的差异基因和信号通路。结果:钙化主动脉瓣膜组织相对于对照组组织样本,胶原纤维和钙盐沉积显著增多,TUNEL凋亡实验表明凋亡指数也明显增多;WB和IHC实验表明在钙化主动脉瓣膜组织中,PI3K/AKT信号通路和AMPK的表达明显降低,然而NF-κB信号通路、AVICs成骨标志物（BMP2和osteopontin）和凋亡（BAX/BCL2）显著上调。PM处理AVICs可以显著降低PI3K/AKT信号通路的表达,刺激NF-κB信号通路、AVICs成骨标志物（BMP2和osteopontin）和凋亡蛋白BAX、caspase 3的表达。metformin（10 μM、100 μM和1mM）可以显著上调PI3K/AKT信号通路的表达,抑制NF-κB信号通路、AVICs成骨标志物（BMP2和osteopontin）和凋亡蛋白BAX、caspase 3的表达,且在浓度为100μM时,其有效作用便可达到很好的效果。使用抑制剂或siRNA抑制AMPK或PI3κ/AKT的表达,可以显著抑制metformin的抗钙化和抗凋亡效果;抑制NF-κB信号通路的表达,同样可以抑制PM诱导的钙盐沉积作用。转录组测序结果显示metformin调控CAVD钙盐沉积的差异基因主要富集在R3K/AKT和NF-κB等信号通路上。结论:本研究发现在钙化主动脉瓣膜组织和PM诱导的AVICs内,PI3K/AKT信号通路的表达显著降低、NF-κB信号通路显著上调、凋亡指数明显升高;据我们所知,本研究首次报道了 metformin可以通过激活PI3K/AKT信号通路发挥抑制AVICs成骨转化和钙盐沉积的作用,并依赖于AMPK的激活。metformin是一种潜在的治疗CAVD的很有前景的药物,并且PI3K/AKT信号通路与CAVD的分子机制密切相关。