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目的:探索手术切除的成人良性病变肝叶的肝细胞分离技术,提高成人原代肝细胞的产量、纯度、活率;研究培养过程中肝细胞的生化改变及向胆管分化的检测;对肝细胞冻存方案进行探索。方法:选择肝内外胆管结石的手术切除肝叶标本,采用改良胶原酶灌注分离法分离肝细胞,用血球计数板计数法对分离后的新鲜肝细胞计数,用台盼蓝拒染法及流式细胞仪活细胞荧光染色(FACS)检测新鲜肝细胞活率;全自动生化分析仪检测成人原代肝细胞在培养过程的生化改变,细胞免疫荧光技术及荧光标记的胆酸类似物CDFDA检测肝细胞向胆管上皮细胞的分化情况;用不同浓度的DMSO、血清配成冻存液冻存肝细胞,用台盼蓝拒染法及FACS检测冻存复苏后肝细胞活率。结果:新鲜分离的成人原代肝细胞计数达109个,台盼蓝拒染法检测肝细胞活率达85%,流式细胞仪活细胞荧光染色(FACS)活率可达84%;培养的过程中,ALT、AST、LDH的泄漏率呈下降后上升的趋势,在培养3天时达到最低,培养4天时开始上升,白蛋白的分泌量方面,在培养3天时达到最高,培养4天时开始下降;细胞免疫荧光技术示成人原代肝细胞在培养4时完全见不到荧光物质,培养5天时可见分布均匀的荧光物质,培养6天时荧光物质变多;经CDFDA检测:培养4天的肝细胞可见零散的点状物质,培养5天的肝细胞可见荧光物质呈线索状,培养6天的肝细胞可见线索状荧光物质增宽;在不同的冻存组中,血清20%+DMS010%+培养基70%的冻存组经复苏后活率远远高于其他条件组。结论:1.改良胶原酶灌注分离法分离肝细胞步骤简单、耗时短、效率高、成本低。2.成人原代肝细胞培养过程中,肝细胞的生化性质在培养3天时最好,此时适合进行生物人工肝及肝细胞移植临床治疗。3.成人原代肝细胞在培养过程中具有向胆管上皮分化的潜能,在培养5天时初步形成,培养6天时进一步形成。4.成人原代肝细胞冻存复苏后活率大大降低,其冻存液中DMSO为10%、胎牛血清为20%组的冻存组活率最高。