论文部分内容阅读
胃癌（gastric cancer,GC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一,也是全球主要的健康问题,尤其是在亚洲。随着分子生物学和表观遗传学等领域的发展,寻找具有敏感性、特异性的诊断生物标志物和分子靶向治疗靶点是当今癌症研究的热点与难点,探索胃癌的调控基因有助于胃癌的精准诊断和治疗,改善患者预后,延长生命周期。长链非编码RNA（long non-coding RNAs,lncRNAs）是一类新的转录本,在当前的研究环境中受到了极大的关注,例如致癌作用。最近提出一种RNA间相互作用的新机制,即竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA,ce RNA）,是指lncRNA、m RNA和假基因转录物等转录本通过miRNA应答元件（micro RNA response elements,MREs）竞争结合相同的miRNA来调节基因表达,从而影响细胞的功能。原理在于既往研究揭示miRNA可以通过结合m RNA导致基因抑制,而ce RNA通过竞争性地结合miRNA使其失效来调节基因表达。ASNR（apoptosis suppressing-noncoding RNA）是一种与细胞凋亡相关的因子,在GC中尚未见报道。本研究通过细胞实验和临床标本检测分析ASNR在GC发展中的作用及其机制,进而为找到有效调控GC发展的重要分子指导临床诊断及研发分子靶向药物提供研究基础。第一部分lncRNAASNR在胃癌中的表达及与临床病理特征关系的研究目的:验证ASNR在胃癌组织、癌旁组织、人类胃黏膜上皮细胞系和在不同分化程度人类胃癌细胞系中的表达差异,及其与胃癌患者多种临床病理学参数的关系。方法:1.GEPIA2分析ASNR基因在胃癌中的表达以及和五年生存期的关系。2.应用RT-qPCR分析76对胃癌组织和癌旁组织中ASNR的表达。3.分析ASNR的表达情况与胃癌患者临床病理学特征的之间的关系。4.通过RT-qPCR检测4株分化程度不同的人胃癌细胞株（MKN28、AGS、MKN45、HGC27）和永生化人胃黏膜上皮细胞株（GES-1）中ASNR的表达水平。结果:1.生信分析结果显示,ASNR在胃癌组织中呈高表达,且ASNR表达影响患者的总生存率和无病生存率（P＜0.05）。2.RT-qPCR结果显示:与癌旁组织相比,胃癌组织ASNR表达水平显著升高（P＜0.05）。3.表达水平与临床病理特征分析结果显示:ASNR表达水平上调与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤细胞分化情况、是否远端转移无关,而与肿瘤大小、Lauren分型、组织分化、浸润程度、淋巴结转移及肿瘤的TNM分期显著相关（P＜0.05）。4.单变量生存分析结果表明:总生存率（overall survival,OS）与肿瘤大小,Lauren分类,分化程度,浸润程度,TNM分期和ASNR表达水平显著相关（P＜0.05）。多因素Cox回归分析结果表明:ASNR表达水平和组织分化程度是患者的独立预后因素。生存分析显示:ASNR高表达水平的患者的OS短于ASNR低表达水平的患者（P＜0.05）。5.RT-qPCR结果显示:与GES-1细胞株相比,HGC27、MKN45、MKN28、AGS细胞株中ASNR表达水平均显著升高（P＜0.05）。小结:lncRNAASNR具有原癌基因特征,影响胃癌患者预后,可能成为潜在的胃癌肿瘤标志物之一。第二部分lncRNAASNR对胃癌细胞的生物学功能的影响目的:1.研究过表达ASNR后对人胃癌细胞株MKN28增殖、侵袭、迁移能力的影响。2.研究抑制ASNR后对人胃癌细胞株MKN45增殖、侵袭和迁移能力的影响。3.研究稳定抑制ASNR后对人胃癌细胞株AGS在裸鼠体内的成瘤能力及瘤体生长的影响,通过裸鼠体内实验来探讨其在胃癌发展中的作用。方法:1.构建能有效扩增ASNR的pc DNA3.1（+）载体质粒,并且将质粒转染至MKN28细胞株中。应用RT-qPCR检测过表达效率。2.应用MTT方法研究过表达ASNR后对MKN28细胞增殖的影响。3.通过RT-qPCR及Western blot技术检测过表达ASNR对PCNA m RNA及蛋白表达的影响。4.应用流式细胞术技术研究过表达ASNR后对MKN28细胞周期的影响,并通过RT-qPCR及Western blot技术检测过表达ASNR对细胞周期蛋白表达的影响。5.通过细胞划痕和Transwell技术检测过表达ASNR对MKN28细胞迁移和侵袭的作用,并通过RT-qPCR及Western blot技术检测过表达ASNR后对侵袭和迁移蛋白表达的影响。6.通过RT-qPCR及Western blot技术检测过表达ASNR对MKN28细胞中上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）蛋白的影响。7.使用能够特异性下调ASNR的小干扰RNA,并且转染至MKN45细胞株中。应用RT-qPCR检测抑制效率。8.应用MTT方法研究抑制ASNR后对MKN45细胞增殖的影响。9.通过RT-qPCR及Western blot技术检测抑制ASNR对PCNA m RNA及相关蛋白表达的影响。10.应用流式细胞术技术研究抑制ASNR后对MKN45细胞周期的影响,并通过RT-qPCR及Western blot技术检测下调ASNR对细胞周期蛋白表达的影响11.通过细胞划痕和Transwell技术检测下调ASNR的MKN45细胞迁移和侵袭的作用,并通过RT-qPCR及Western blot技术检测下调ASNR后对侵袭和迁移蛋白表达的影响。12.通过RT-qPCR及Western blot技术检测下调ASNR对MKN45细胞中EMT蛋白的影响。13.通过形态学观察法、H＆E染色法和免疫组织化学法检测下调ASNR对AGS细胞裸鼠体内成瘤的影响。结果:1.RT-qPCR结果表明:与Control和Vector组（Negative control）的结果相比,pc DNA3.1-ASNR转染组（Transferred group）细胞株的ASNR表达水平明显升高,并且在浓度为2μg时效果最为明显,差异具有统计学意义（P＜0.05）。Control组及Vector组间无差异。2.MTT结果显示:与Control和Vector组相比,过表达ASNR后MKN28细胞株的48h OD值显著升高（P＜0.05）,Control组及Vector组间无差异。3.RT-qPCR及Western blot结果表明:与Control和Vector组相比,过表达ASNR后MKN28细胞株的PCNA表达水平明显升高（P＜0.05）,Control组及Vector组间无差异。4.流式细胞术结果显示:与Control和Vector组相比,过表达ASNR后MKN28细胞株处于G0/G1期的比例显著降低（P＜0.05）,处于S期及G2/M期的比例显著升高（P＜0.05）,而且处于G2/M期的比例升高最为显著,Control组及Vector组间无差异。5.RT-qPCR及Western blot结果表明:过表达ASNR转染组Cyclin A、Cyclin D1及Cyclin E表达水平较Control组及Vector组明显升高（P＜0.05）,而P21、P27表达水平较Control组及Vector组明显降低,Control组及Vector组间无差异。6.细胞划痕实验结果显示:与Control和Vector组相比,过表达ASNR后MKN28细胞株的平面迁移活性明显增强（P＜0.05）,Control组及Vector组间无差异。7.细胞侵袭评价结果表明:与Control和Vector组相比,过表达ASNR的MKN28细胞株通过Transwell小室基质胶的细胞显著增多（P＜0.05）,Control组及Vector组间无差异。8.RT-qPCR及Western blot结果表明:与Control和Vector组相比,过表达ASNR转染组MMP2、MMP9及ICAM1表达水平显著升高（P＜0.05）,而转染组TIMP1、TIMP2、NM23表达水平较Control组及Vector组明显降低（P＜0.05）,Control组及Vector组间无差异。9.RT-qPCR及Western blot结果表明:过表达ASNR转染组N-cadherin、Snail、ZEB1、Twist及Vimentin表达水平较Control和Vector组明显升高（P＜0.05）,而转染组E-cadherin表达水平较Control和Vector组显著下降（P＜0.05）,Control组及Vector组间无差异。10.RT-qPCR结果显示:与Control和si-NC组结果相比,si-ASNR转染组（Transferred group）细胞株的ASNR表达水平显著下降,并且以si RNA3效果最为明显,差异具有统计学意义（P＜0.05）,Control组及si-NC组间无差异。11.MTT结果显示:与Control和si-NC组相比,抑制ASNR后MKN28细胞株的48h OD值显著降低（P＜0.05）,Control组及si-NC组间无差异。12.RT-qPCR及Western blot结果显示:与Control和si-NC组相比,下调ASNR的MKN45细胞中PCNA表达水平明显降低（P＜0.05）,Control组及si-NC组间无差异。13.流式细胞术结果显示:与Control和si-NC组相比,抑制ASNR后MKN45细胞株处于G0/G1期的比例显著升高（P＜0.05）,处于S期及G2/M期的比例显著降低（P＜0.05）,而且处于G0/G1期的比例降低最为显著,Control组及si-NC组间无差异。14.RT-qPCR及Western blot结果显示:抑制ASNR转染组Cyclin A、Cyclin D1及Cyclin E表达水平较Control和si-NC组明显降低（P＜0.05）,而P21、P27表达水平较Control组及si-NC组明显升高,Control组及si-NC组间无差异。15.细胞划痕实验结果显示:与Control和si-NC组相比,抑制ASNR后MKN45细胞株的平面迁移活性明显减弱（P＜0.05）,Control组及si-NC组间无差异。16.细胞侵袭评价结果表明:与Control和si-NC组相比,抑制ASNR的MKN45细胞通过Transwell小室基质胶的细胞显著减少（P＜0.05）,Control组及si-NC组间无差异。17.RT-qPCR及Western blot结果显示:与Control和si-NC组相比,抑制ASNR转染组MMP2、MMP9及ICAM1表达水平显著下调（P＜0.05）,而转染组TIMP1、TIMP2、NM23表达水平较Control组及Vector组明显升高（P＜0.05）,Control组及si-NC组间无差异。18.RT-qPCR及Western blot结果显示:抑制ASNR转染组N-cadherin、Snail、ZEB1、Twist及Vimentin表达水平较Control组及si-NC组显著下调（P＜0.05）,而转染组E-cadherin表达水平较Control组及si-NC组明显升高（P＜0.05）,Control组及si-NC组间无差异。19.形态学观察结果显示:sh-NC组（Negative control）和sh-Lnc＿ASNR组（Experimental group）裸鼠移植瘤的平均体积分别为（1058.4±120.0 mm~3）、（596.4±100.0 mm~3）,裸鼠移植瘤的平均重量分别为（1226.6±124.7 mg）、（602.4±87.0 mg）,且sh-ASNR组裸鼠移植瘤的生长速度和重量较sh-NC组均明显降低（P＜0.05）。20.H＆E染色法结果显示:与sh-NC组相比,sh-Lnc＿ASNR组中裸鼠移植瘤组织坏死明显增多。21.免疫组织化学结果显示:与sh-NC组相比,sh-Lnc＿ASNR组中裸鼠移植瘤组织中Ki-67阳性率明显降低。22.Western blot结果显示:与sh-NC组相比,sh-Lnc＿ASNR组中裸鼠移植瘤组织中PCNA、MMP2、MMP9及ICAM1表达水平较Control组及si-NC组显著下调,而NM23表达水平较Control组及Vector组明显升高。小结:1.成功获得过表达ASNR的MKN28细胞系。2.过表达ASNR可明显增强MKN28细胞株的细胞增殖能力,可能与PCNA表达水平上调有关。3.过表达ASNR后MKN28细胞株的细胞增殖能力增强,可能与Cyclin A、Cyclin D1及Cyclin E表达水平上调及P21、P27表达水平下调有关。4.过表达ASNR可明显增强MKN28细胞株的迁移和侵袭能力,可能与MMP2、MMP9及ICAM1表达上调及TIMP1、TIMP2及NM23表达下调有关。5.过表达ASNR的MKN28细胞株内E-cadherin表达显著降低、N-cadherin、Snail、ZEB1、Twist及Vimentin表达显著提高,因此过表达ASNR可能促进了MKN28细胞株EMT的发生。6.成功构建出能有效抑制ASNR的人胃癌细胞株MKN45。7.抑制ASNR可明显减弱MKN45细胞株的细胞增殖能力,可能与PCNA表达水平下调有关。8.抑制ASNR后MKN45细胞株处于G0/G1期的比例显著升高（P＜0.05）,处于S期及G2/M期的比例显著降低（P＜0.05）,细胞增殖能力减弱,可能与Cyclin A、Cyclin D1及Cyclin E表达水平下调及P21、P27表达水平上调有关。9.抑制ASNR可明显减弱MKN45细胞株的迁移和侵袭能力,可能与MMP2、MMP9及ICAM1表达水平下调及TIMP1、TIMP2、NM23表达水平上调有关。10.抑制ASNR的MKN45细胞株内E-cadherin表达显著提高及N-cadherin、Snail、ZEB1、Twist及Vimentin表达显著降低,因此抑制ASNR可能抑制了MKN45细胞株EMT的发生。11.成功构建出稳定抑制ASNR的人胃癌细胞株AGS。12.抑制ASNR后裸鼠体内成瘤的体积及重量明显降低,裸鼠移植瘤组织坏死明显增多,提示抑制ASNR后可以减弱AGS细胞株在裸鼠体内成瘤能力以及抑制了瘤体的生长,从而引起PCNA、MMP2、MMP9及ICAM1表达水平下调及NM23表达水平上调。第三部分lncRNAASNR对胃癌细胞影响的分子机制研究目的:1.研究胃癌细胞中ASNR和miR-519e-5p以及FGFR2的相互作用关系,阐明ASNR发挥作用的机制,揭示ASNR/miR-519e-5p/FGFR2在胃癌发展中潜在的临床应用价值作用。2.验证miR-519e-5p以及FGFR2在胃癌组织、癌旁组织、人胃正常粘膜细胞株及不同分化程度人胃癌细胞株中的表达水平。3.研究ASNR/miR-519e-5p/FGFR2对人胃癌细胞系侵袭和迁移的影响。方法:1.生物信息学分析预测ASNR和miR-519e-5p、miR-519e-5p和FGFR2之间的潜在结合位点。2.应用双荧光素酶报告基因检测ASNR和miR-519e-5p、miR-519e-5p和FGFR2之间的靶向调控作用。3.应用RT-qPCR技术检测60对胃癌组织和癌旁组织中miR-519e-5p的表达水平。4.应用RT-qPCR技术检测60对胃癌组织和癌旁组织中FGFR2的表达水平。5.应用RT-qPCR技术检测4株不同分化程度的人胃癌细胞株（MKN28、AGS、MKN45、HGC27）和永生化人胃正常粘膜细胞株（GES-1）中FGFR2的表达水平。6.应用RT-qPCR技术检测过表达ASNR的MKN28细胞株及抑制ASNR的MKN45细胞株中miR-519e-5p的表达水平。7.应用RT-qPCR以及Western blot实验检测转染了miR-519e-5p模拟物的MKN28细胞中miR-519e-5p、FGFR2及其蛋白表达水平变化。8.应用RT-qPCR以及Western blot实验检测转染了miR-519e-5p抑制剂的MKN45细胞中miR-519e-5p、FGFR2及其蛋白表达水平变化。9.应用RT-qPCR以及Western blot实验检测影响ASNR/miR-519e-5p/FGFR2通路后,MKN28和MKN45细胞中FGFR2及其蛋白表达水平变化。10.应用细胞划痕和Transwell实验检测ASNR/miR-519e-5p/FGFR2通路对胃癌细胞迁移和侵袭的影响。结果:1.miRDB（http://mirdb.org/）和Targetscan（http://www.targetscan.org/）网站分析结果显示:ASNR和miR-519e-5p、miR-519e-5p和FGFR2之间存在结合位点。2.双荧光素酶报告基因结果显示:转染miR-519e-5p模拟物的MKN45细胞株中ASNR-wild组的荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）,而ASNR-mut组的荧光素酶活性无明显变化。转染miR-519e-5p模拟物的MKN45细胞株中FGFR2-wild组的荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）,而FGFR2-mut组的荧光素酶活性无明显变化。3.RT-qPCR结果显示:与癌旁组织相比,胃癌组织中miR-519e-5p表达显著降低（P＜0.05）。4.RT-qPCR结果显示:与癌旁组织相比,胃癌组织中FGFR2表达显著升高（P＜0.05）。5.RT-qPCR结果显示:与GES-1细胞株相比,HGC27、MKN45、MKN28、AGS细胞株中FGFR2表达水平均显著升高（P＜0.05）。6.RT-qPCR结果显示:过表达ASNR的MKN28细胞株中miR-519e-5p的表达水平显著降低（P＜0.05）,抑制ASNR的MKN45细胞株中miR-519e-5p的表达水平显著升高（P＜0.05）。7.RT-qPCR以及Western blot评价结果表明:转染miR-519e-5p模拟物的MKN45细胞株中miR-519e-5p的表达水平明显升高（P＜0.05）,而FGFR2及其蛋白的表达水平明显降低（P＜0.05）。8.RT-qPCR以及Western blot评价结果表明:转染miR-519e-5p抑制剂的MKN28细胞株中miR-519e-5p的表达水平明显降低（P＜0.05）,而FGFR2及其蛋白的表达水平明显升高（P＜0.05）。9.RT-qPCR以及Western blot评价结果表明:转染pc DNA3.1-Lnc＿ASNR的MKN28细胞株中FGFR2及其蛋白的表达水平明显升高（P＜0.05）;而共转染pc DNA3.1-ASNR+miR-519e-5p模拟物的MKN28细胞株中FGFR2及其蛋白的表达水平上调取消。转染si-ASNR的MKN45细胞株中FGFR2及其蛋白的表达水平明显下降（P＜0.05）;而共转染si-ASNR+miR-519e-5p抑制物的MKN45细胞株中FGFR2及其蛋白的表达水平恢复。10.细胞划痕实验结果显示:与Control组及Vector组相比,过表达ASNR后MKN28细胞株的平面迁移活性明显增强（P＜0.05）,而共转染pc DNA3.1-ASNR+miR-519e-5p模拟物的MKN28细胞株平面迁移活性增强被抵消,Control组及Vector组间无差异。11.Transwell细胞侵袭实验结果显示:与Control组及Vector组相比,过表达ASNR后MKN28细胞株通过Transwell小室基质胶的细胞数明显增多（P＜0.05）,而共转染pc DNA3.1-ASNR+miR-519e-5p模拟物的MKN28细胞株通过Transwell小室基质胶的细胞数与Control组及Vector组间相比无差异,Control组及Vector组间无差异。12.细胞划痕实验结果显示:与Control组及si-NC组相比,抑制ASNR后MKN45细胞株的平面迁移活性明显减弱（P＜0.05）,而共转染si-ASNR+miR-519e-5p抑制物的MKN45细胞株平面迁移活性减弱被逆转,Control组及si-NC组间无差异。13.Transwell细胞侵袭实验结果显示:与Control组及si-NC组相比,抑制ASNR后MKN45细胞株通过Transwell小室基质胶的细胞数明显减少（P＜0.05）,而共转染si-ASNR+miR-519e-5p抑制物的MKN45细胞株通过Transwell小室基质胶的细胞数与Control组及si-NC组间相比无差异,Control组及si-NC组间无差异。小结:1.验证ASNR和miR-519e-5p、miR-519e-5p和FGFR2之间存在结合位点。2.通过对ASNR/miR-519e-5p/FGFR2通路的影响,研究发现ASNR充当miR-519e-5p的ce RNA,从而使FGFR2及其蛋白的表达水平上升。3.ASNR/miR-519e-5p/FGFR2轴促进了胃癌细胞的侵袭能力和迁移能力。结论:1.胃癌组织ASNR表达水平显著提高,且与患者肿瘤体积、浸润程度、局部淋巴结转移及TNM分期显著相关,影响患者的预后;在HGC27、MKN45、AGS及MKN28细胞中ASNR表达均上调。2.过表达ASNR可明显增强MKN28细胞株的迁移和侵袭能力,可能与MMP2、MMP9及ICAM1表达水平上调及TIMP1、TIMP2及NM23表达水平下调有关。而抑制ASNR后能在体外及体内显著抑制MKN28胃癌细胞株的增殖、迁移和侵袭能力,可能与MMP2、MMP9及ICAM1表达水平下调及TIMP1、TIMP2及NM23表达水平上调有关。3.过表达ASNR的MKN28细胞内E-cadherin表达显著下调、N-cadherin、Snail、ZEB1、Twist及Vimentin蛋白的表达显著提高,因此过表达ASNR可能促进了MKN28细胞株EMT的发生。而下调ASNR的MKN45细胞内E-cadherin表达显著提高,且N-cadherin、Snail、ZEB1、Twist及Vimentin蛋白的表达显著下调,因此过表达ASNR可能抑制了MKN45细胞株EMT的发生。4.ASNR充当miR-519e-5p的ce RNA,从而使FGFR2及其蛋白的表达水平上升,提高了胃癌细胞增殖、迁移和侵袭作用,进而促进了胃癌发展。