在家蚕体内氟化钠与羟基磷灰石纳米颗粒(nano-HAP)的拮抗作用研究

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全世界有两条贯穿于多个国家的高氟地带,地壳运动和人类生产活动会使氟遍布于活动区域的水域、陆地和空气中。作为一种环境毒物,氟能积聚在生物体内,氟对动、植物的许多组织、器官的不良影响均有报道。氟能影响线粒体呼吸链,导致活性氧激增而进一步导致氧化应激。而氧化应激会导致线粒体损伤和内质网应激,这些不良影响会进一步引发细胞凋亡,最后扩大为对生物的组织、器官、系统、个体的影响。为探究氟化物对重要经济昆虫——家蚕(Bombyx mori)的影响,以及氟化物与羟基磷灰石纳米颗粒(nano-HAP)在家蚕体内的拮抗作用,本研究选用鳞翅目模式昆虫——家蚕(原种871)为实验对象,采用经口染毒法,将染药的桑叶作为家蚕5龄第1天至第6天的食物,在此期间我们观测了家蚕的各项指标,并在5龄第6天解剖家蚕,取丝腺、血液、蚕沙等作为研究材料冷冻保存。本研究利用了技术如荧光定量PCR、酶标仪应用、组织切片、扫描电镜应用、凝胶电泳、SPSS数据分析等,对实验材料进行处理、检测和数据分析等,探究了nano-HAP颗粒与Na F的拮抗作用对家蚕个体生长发育及经济性状、氧化应激系统及丝腺损伤的影响,以及对家蚕丝腺的丝素分泌、氧化应激、凋亡等基因表达的影响,评价了nano-HAP作为氟离子毒性拮抗剂的作用效果,以寻找氟化物对经济昆虫家蚕的毒性影响的合理控制方法。本研究得到了以下进展:首先,我们以200 mg/L的Na F浓度作为本实验的氟暴露浓度。为探究nano-HAP与Na F在家蚕体内的相互作用,以及确定合适的nano-HAP添加浓度,实验分为5个组喷洒添药:仅添加去离子水的对照组,仅添加200 mg/L的Na F溶液的组,其余为三个Na F-HAP共添组,分为三个nano-HAP浓度:1250 mg/L、2500 mg/L、5000 mg/L,这三个Na F-nano-HAP共添组均同时添加200 mg/L的Na F。经氟离子选择电极检测,nano-HAP的添加不影响桑叶氟的检出,不低于2500mg/L的nano-HAP有助于增加蚕沙氟排出,减少氟离子的肠道吸收和在血液、丝腺中的分布。Na F能导致家蚕个体偏小,体重增长率下降,茧、蛹均偏小,且个体间大小差异大;将未脱胶蚕丝放大20000倍后,可观察到裂痕增多;上簇第七天时,我们发现家蚕体表有许多易扩散、易破裂的黑色斑点,最后全体发黑死亡的未化蛹蚕。并且,后部丝腺的病理组织切片结果表明,与对照组相比,低浓度的nano-HAP处理组和仅添氟的处理组,丝腺的损伤程度最深,包括形成小空泡、胞质不均匀,部分区域细胞核难以分辨。中浓度和高浓度的nano-HAP处理组损伤较小。同时添加nano-HAP颗粒,虽不能完全消除上述影响,但是改善效果是显著的。2500 mg/L的nano-HAP同时添加处理时,氟对家蚕生长发育及重要经济性状的影响可以降至最低。第二,我们检测了nano-HAP颗粒与Na F的共同添加对家蚕氧化应激系统的影响。我们发现Na F能显著降低单位质量的家蚕丝腺的总蛋白浓度,导致GSH浓度降低,SOD酶和GST酶活力升高,MDA含量升高,而2500 mg/L的nano-HAP与Na F的同时添加可最大程度减轻这种影响,nano-HAP浓度过高会使丝腺氧化应激相关SOD、GST酶的活力降低,也降低GSH含量和MDA含量。2500 mg/L的nano-HAP喷洒时,家蚕丝腺组织氧化应激系统受到的影响更少。第三,我们检测了nano-HAP颗粒和Na F的共同添加对家蚕的氧化应激、丝素合成和丝腺凋亡相关基因表达的影响。我们发现2500 mg/L的nano-HAP不仅可以有效抑制Na F对gst1、sod、cat等氧化应激相关基因的上调作用,还可以抑制Na F对凋亡相关的Bcl-2家族基因Buffy和对Casepase-3样基因ICE的上调作用。然而1250 mg/L和5000 mg/L的nano-HAP添加时,这种抑制作用会减弱。此外,Na F抑制871家蚕Fib-H、Fib-L、P25等丝素合成相关的基因的表达,而nano-HAP与Na F共同添加则上调这些基因的表达,这种上调作用,跟凋亡和氧化应激相关基因的上调程度呈正相关。2500 mg/L的nano-HAP颗粒能最充分地拮抗Na F对家蚕的氧化应激、丝素合成和丝腺凋亡相关基因表达的影响。本实验证明了nano-HAP可通过减少生物对氟的吸收而减少氟在家蚕内分布,以此减少了相同暴露剂量下氟对家蚕的影响,证明了nano-HAP作为氟离子毒性拮抗剂的有效性。在桑叶单面喷洒药物的基础上,200 mg/L Na F存在时,同时添加2500 mg/L的nano-HAP,可最大程度改善Na F对家蚕的个体水平、组织和酶水平、分子水平上的不良影响,nano-HAP的浓度过高或者过低这种改善作用会弱化。本研究为探索氟对生物不良影响的控制方法的研究打下一定基础。对控制氟对重要经济昆虫家蚕的不良影响具有重要的生产实践意义。
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