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研究目的：高糖摄取与糖尿病发生率之间有显著的相关性，但内在的机制仍不清楚。本研究以每日四次葡萄糖灌胃模型来模拟人的每日多次进食习惯，探寻频繁糖摄入/氧化应激波动对胰岛β-细胞去分化及其功能、前驱糖尿病的病理发生机制及其信号通路等方面的影响。在此基础上，研究了抗氧化剂谷胱甘肽（glutathione，GSH）对频繁高糖摄入所导致的前驱糖尿病的防治作用。
研究方法：1.选用体重为200±10g的Sprague-Dawley雌性大鼠，每6小时（分别在06:20,12:20,18:20和24:20h）给予动物6g/kg葡萄糖或蒸馏水（2mL/100g)灌胃，持续38天，将其标定为长期多次灌胃葡萄糖组（long-termoscillatingglucose,LOsG）或对照组（Sham）；此外，一组大鼠在LOsG处理的同时，给予GSH（50mg/kg/6h，皮下注射）以拮抗活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）的作用，标定为长期多次灌胃葡萄糖及皮下注射GSH组（LOsG+timelyanddynamicadministrationofGSH,LOsG.TdGSH)组。2.每天记录体重。在实验的P7，P14，P21，P28和P38天检测空腹血糖（fastingbloodglucose,FBG）。3.在P38天，对过夜禁食12h的大鼠采血:用ELISA法测量空腹血浆胰岛素;血浆生化分析以检测胆固醇，甘油三酯，高密度脂蛋白，低密度脂蛋白和脂肪酶含量；分离纯化出白细胞（whitebloodcell,WBC），用流式细胞术检查WBC的存活率，用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（dichlorodihydrofluoresceindiacetate,DCFH-DA）检测WBCROS含量。4.对过夜禁食12h的大鼠做口服葡萄糖耐量试验（Oralglucosetolerancetest,OGTT）。5.在P38天取胰腺，制备组织切片。采用荧光免疫组织化学技术检测大鼠胰腺Insulin、Forkhead转录因子（FoxO1）、硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）、超氧化物歧化酶（SOD-2）、神经元素3（Neurogenin-3,Nurog3）等相关蛋白表达及其含量。6.用活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）荧光探针二氢乙锭(Dihydroethidium,DHE）检测胰腺组织原位ROS含量。7.采用TUNEL（TdT-mediateddUTPNick-EndLabeling）法检测胰腺组织细胞凋亡。8.应用Q-RT-PCR测定胰腺中Insulin、Glucagon以及FoxO1mRNA的相对表达水平；WesternBlot检测胰腺FoxO1、SOD-2、NADPH氧化酶4(NOX4)蛋白相对表达量。
研究结果：1.同Sham组比，LosG处理没有明显改变大鼠体重、FBG水平和血浆脂质谱。但OGTT实验结果显示，LOsG组在90min和120min测得的血糖异常，其水平显著高于Sham组(90min:p＜0.001;120min:p＜0.01)，LOsG.TdGSH处理完全防止了LosG导致的OGTT异常改变（90min:p＜0.001;120min:p＜0.01）。同时，LOsG.TdGSH处理也防止了LosG处理导致的空腹血浆胰岛素水平的显著降低（p＜0.05）。
2.同对照组相比，免疫组织化学分析显示，LOsG处理显著降低了胰岛Insulin含量。qRT-PCR检测表明，LOsG这个效应是通过显著降低了胰岛素mRNA表达而达成。而TdGSH完全阻断了LOsG导致的胰岛素mRNA和蛋白质表达的降低。此外，根据LOsG组的胰岛素免疫反应半定量分析，经LOsG处理后的胰岛可分为3个不同胰岛素含量的群体：12.6±5.0％的高（此群体胰岛素含量为对照组胰岛素含量的65±4％），56.5±4.4％的中等（此群体胰岛素含量为对照组胰岛素含量的29±1％）和30.9±7.3％的低（此群体胰岛素含量为对照组胰岛素含量的6±1％）胰岛素含量的胰岛。这表明LOsG处理的胰腺中有31%的胰岛已经基本丧失了β-细胞特性。
3.在生理条件下，对照组大鼠的胰腺腺泡细胞基础ROS浓度，约为胰岛β-细胞的3.9倍。在LOsG处理情况下，腺泡细胞中仅产生1.2倍的ROS增加，但在β-细胞中ROS产生增加4.5倍（p＜0.001），提示β-细胞对高糖所导致的ROS代谢改变，缺乏有效的应对机制。LosG处理导致的ROS积累效应明显高于Sham组（p＜0.001）和LOsG.TdGSH组（p＜0.01），且LOsG组大鼠血糖水平和WBCROS积累呈正相关（r=0.61，n=14，p＜0.05），而其它组则无此相关性。LOsG.TdGSH组中葡萄糖刺激的ROS积累幅度与对照组大鼠的相似，提示动态及时地给予GSH可以防止高糖导致的ROS在细胞内的堆积。
4.免疫荧光半定量检测胰腺中氧化应激指标SOD-2的表达结果显示，在正常胰腺组织，胰岛中SOD-2相对含量比腺泡细胞高19.5倍。LOsG处理，致使胰岛β-细胞中SOD-2含量显著减少，而TdGSH处理完全阻止了LOsG所引起的胰岛β-细胞中SOD-2含量的改变。在腺泡，尽管LOsG处理也抑制了腺泡细胞SOD-2的表达，但它的表达量仍占Sham组表达的58％，这与WB的结果一致。胰岛SOD-2和Insulin的双重免疫染色显示，胰岛SOD-2和Insulin表达之间存在显著正相关（r=0.66，n=133，p＜0.001）。此外，免疫荧光半定量结果显示，LOsG处理没有明显改变胰腺NOX4蛋白表达。
5.采用qRT-PCR、免疫组织化学分析和WesternBlot检测等研究表明，与Sham组相比，LOsG在P38天显著降低了FoxO1mRNA和蛋白质表达。TdGSH预防了LOsG诱导的FoxO1下调。FoxO1和Insulin双重免疫染色证明FoxO1和Insulin之间，有正相关关系。β-细胞中TXNIP和MafA的相对表达量检测结果显示，与Sham组相比，LOsG导致核TXNIP增加3.3倍，核MafA表达减少4.9倍，而TdGSH完全阻断LOsG分别诱导的TXNIP/MafA表达的改变。TXNIP和Insulin表达之间存在负相关，MafA与Insulin表达呈正相关。这些结果提示，LOsG/ROS可通过FoxO1/TXNIP/MafA通路调控胰岛素的分泌。
6.在LOsG/ROS刺激下，部分丧失了胰岛素分泌功能的β-细胞开始重新表达胚胎期核Nurog3，并将胰腺/十二指肠同源框蛋白1（Pdx1）从细胞质显著迁移至核。一些腺泡细胞在LOsG/ROS应激下也表达出高水平的核Nurog3和Pdx1。这提示在LOsG/ROS刺激下，胰腺部分细胞发生了细胞去分化的改变。
7.通过TUNEL测定细胞凋亡研究表明，相对于Sham组，LOsG处理没有显著增加胰岛中的凋亡细胞数目。结合免疫组化分析结果，各组间胰岛面积和胰岛密度无差异，所以，LOsG组β-细胞功能衰竭的原因很难解释为LOsG处理导致的β-细胞凋亡。
结论和意义：LOsG处理大鼠38天即可导致β-细胞获得ROS应激性代谢记忆、降低FoxO1表达，继而通过FoxO1通路导致β-细胞去分化而丧失分泌胰岛素的功能，从而发展为具有低胰岛素血症和OGTT受损表现的前驱糖尿病。在LOsG导致的前驱糖尿病发病过程中，胰岛细胞的凋亡所起的作用很小。动态及时地给予GSH可预防LOsG/ROS诱导的因β-细胞去分化而导致的胰岛功能衰竭。故我们提出ROS应激是LOsG诱导前驱糖尿病发生的关键始动步骤。及时适量地给予GSH，可为前驱糖尿病的发生和发展提供一种新的防治方法。
研究方法：1.选用体重为200±10g的Sprague-Dawley雌性大鼠，每6小时（分别在06:20,12:20,18:20和24:20h）给予动物6g/kg葡萄糖或蒸馏水（2mL/100g)灌胃，持续38天，将其标定为长期多次灌胃葡萄糖组（long-termoscillatingglucose,LOsG）或对照组（Sham）；此外，一组大鼠在LOsG处理的同时，给予GSH（50mg/kg/6h，皮下注射）以拮抗活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）的作用，标定为长期多次灌胃葡萄糖及皮下注射GSH组（LOsG+timelyanddynamicadministrationofGSH,LOsG.TdGSH)组。2.每天记录体重。在实验的P7，P14，P21，P28和P38天检测空腹血糖（fastingbloodglucose,FBG）。3.在P38天，对过夜禁食12h的大鼠采血:用ELISA法测量空腹血浆胰岛素;血浆生化分析以检测胆固醇，甘油三酯，高密度脂蛋白，低密度脂蛋白和脂肪酶含量；分离纯化出白细胞（whitebloodcell,WBC），用流式细胞术检查WBC的存活率，用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（dichlorodihydrofluoresceindiacetate,DCFH-DA）检测WBCROS含量。4.对过夜禁食12h的大鼠做口服葡萄糖耐量试验（Oralglucosetolerancetest,OGTT）。5.在P38天取胰腺，制备组织切片。采用荧光免疫组织化学技术检测大鼠胰腺Insulin、Forkhead转录因子（FoxO1）、硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）、超氧化物歧化酶（SOD-2）、神经元素3（Neurogenin-3,Nurog3）等相关蛋白表达及其含量。6.用活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）荧光探针二氢乙锭(Dihydroethidium,DHE）检测胰腺组织原位ROS含量。7.采用TUNEL（TdT-mediateddUTPNick-EndLabeling）法检测胰腺组织细胞凋亡。8.应用Q-RT-PCR测定胰腺中Insulin、Glucagon以及FoxO1mRNA的相对表达水平；WesternBlot检测胰腺FoxO1、SOD-2、NADPH氧化酶4(NOX4)蛋白相对表达量。
研究结果：1.同Sham组比，LosG处理没有明显改变大鼠体重、FBG水平和血浆脂质谱。但OGTT实验结果显示，LOsG组在90min和120min测得的血糖异常，其水平显著高于Sham组(90min:p＜0.001;120min:p＜0.01)，LOsG.TdGSH处理完全防止了LosG导致的OGTT异常改变（90min:p＜0.001;120min:p＜0.01）。同时，LOsG.TdGSH处理也防止了LosG处理导致的空腹血浆胰岛素水平的显著降低（p＜0.05）。
2.同对照组相比，免疫组织化学分析显示，LOsG处理显著降低了胰岛Insulin含量。qRT-PCR检测表明，LOsG这个效应是通过显著降低了胰岛素mRNA表达而达成。而TdGSH完全阻断了LOsG导致的胰岛素mRNA和蛋白质表达的降低。此外，根据LOsG组的胰岛素免疫反应半定量分析，经LOsG处理后的胰岛可分为3个不同胰岛素含量的群体：12.6±5.0％的高（此群体胰岛素含量为对照组胰岛素含量的65±4％），56.5±4.4％的中等（此群体胰岛素含量为对照组胰岛素含量的29±1％）和30.9±7.3％的低（此群体胰岛素含量为对照组胰岛素含量的6±1％）胰岛素含量的胰岛。这表明LOsG处理的胰腺中有31%的胰岛已经基本丧失了β-细胞特性。
3.在生理条件下，对照组大鼠的胰腺腺泡细胞基础ROS浓度，约为胰岛β-细胞的3.9倍。在LOsG处理情况下，腺泡细胞中仅产生1.2倍的ROS增加，但在β-细胞中ROS产生增加4.5倍（p＜0.001），提示β-细胞对高糖所导致的ROS代谢改变，缺乏有效的应对机制。LosG处理导致的ROS积累效应明显高于Sham组（p＜0.001）和LOsG.TdGSH组（p＜0.01），且LOsG组大鼠血糖水平和WBCROS积累呈正相关（r=0.61，n=14，p＜0.05），而其它组则无此相关性。LOsG.TdGSH组中葡萄糖刺激的ROS积累幅度与对照组大鼠的相似，提示动态及时地给予GSH可以防止高糖导致的ROS在细胞内的堆积。
4.免疫荧光半定量检测胰腺中氧化应激指标SOD-2的表达结果显示，在正常胰腺组织，胰岛中SOD-2相对含量比腺泡细胞高19.5倍。LOsG处理，致使胰岛β-细胞中SOD-2含量显著减少，而TdGSH处理完全阻止了LOsG所引起的胰岛β-细胞中SOD-2含量的改变。在腺泡，尽管LOsG处理也抑制了腺泡细胞SOD-2的表达，但它的表达量仍占Sham组表达的58％，这与WB的结果一致。胰岛SOD-2和Insulin的双重免疫染色显示，胰岛SOD-2和Insulin表达之间存在显著正相关（r=0.66，n=133，p＜0.001）。此外，免疫荧光半定量结果显示，LOsG处理没有明显改变胰腺NOX4蛋白表达。
5.采用qRT-PCR、免疫组织化学分析和WesternBlot检测等研究表明，与Sham组相比，LOsG在P38天显著降低了FoxO1mRNA和蛋白质表达。TdGSH预防了LOsG诱导的FoxO1下调。FoxO1和Insulin双重免疫染色证明FoxO1和Insulin之间，有正相关关系。β-细胞中TXNIP和MafA的相对表达量检测结果显示，与Sham组相比，LOsG导致核TXNIP增加3.3倍，核MafA表达减少4.9倍，而TdGSH完全阻断LOsG分别诱导的TXNIP/MafA表达的改变。TXNIP和Insulin表达之间存在负相关，MafA与Insulin表达呈正相关。这些结果提示，LOsG/ROS可通过FoxO1/TXNIP/MafA通路调控胰岛素的分泌。
6.在LOsG/ROS刺激下，部分丧失了胰岛素分泌功能的β-细胞开始重新表达胚胎期核Nurog3，并将胰腺/十二指肠同源框蛋白1（Pdx1）从细胞质显著迁移至核。一些腺泡细胞在LOsG/ROS应激下也表达出高水平的核Nurog3和Pdx1。这提示在LOsG/ROS刺激下，胰腺部分细胞发生了细胞去分化的改变。
7.通过TUNEL测定细胞凋亡研究表明，相对于Sham组，LOsG处理没有显著增加胰岛中的凋亡细胞数目。结合免疫组化分析结果，各组间胰岛面积和胰岛密度无差异，所以，LOsG组β-细胞功能衰竭的原因很难解释为LOsG处理导致的β-细胞凋亡。
结论和意义：LOsG处理大鼠38天即可导致β-细胞获得ROS应激性代谢记忆、降低FoxO1表达，继而通过FoxO1通路导致β-细胞去分化而丧失分泌胰岛素的功能，从而发展为具有低胰岛素血症和OGTT受损表现的前驱糖尿病。在LOsG导致的前驱糖尿病发病过程中，胰岛细胞的凋亡所起的作用很小。动态及时地给予GSH可预防LOsG/ROS诱导的因β-细胞去分化而导致的胰岛功能衰竭。故我们提出ROS应激是LOsG诱导前驱糖尿病发生的关键始动步骤。及时适量地给予GSH，可为前驱糖尿病的发生和发展提供一种新的防治方法。