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目的:地方性氟中毒在我国发病率、波及人口数均占世界首位,对人民健康造成极大威胁,氟中毒患者不仅会出现氟斑牙和氟骨症的症状,而且会有不同程度的神经系统症状。有研究发现慢性氟中毒会引起智力的改变。但是氟致脑损伤的机制,至今不清楚。小胶质细胞(Microglia,MG)是脑组织中休眠的巨噬细胞,在中枢神经系统免疫和炎症反应中起重要作用。但过度活化的小胶质细胞通过分泌细胞因子、炎症介质等物质影响神经细胞,诱导脑内的炎症反应。我们的前期工作已发现氟可活化小胶质细胞,使活性氧(reactive oxygen species,ROS),自由基含量增加。然而氟在体内对中枢神经系统小胶质细胞的作用和炎性因子表达状况尚不清楚。本研究通过体外培养小胶质细胞和体内动物实验两方面,了解氟诱导的小胶质细胞活化所产生炎性因子白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的情况,观察大鼠脑病理改变和凋亡情况,并通过检测小胶质细胞分裂素活化蛋白激酶(moitogen-activated protein kinase,MAPK)和核转录因子κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路的变化探讨氟致小胶质细胞释放这些炎性因子的路径,为探索氟致中枢神经系统损伤机制,采取有效干预措施提供依据。研究方法:1、动物实验:选用中国医科大学实验动物中心提供的Wistar大鼠60只,雌雄各半,分对照组、F~-浓度60 ppm氟暴露组、F~-浓度120 ppm氟暴露组。采用氟离子选择电极测定大鼠血清氟含量,采用酶标仪-氟试剂分光光度法检测脑组织中氟含量。并在光镜和透射电镜下进行脑组织病理学观察。免疫荧光方法检测大鼠脑小胶质细胞活化状态。双荧光免疫方法和western blot方法检测炎性因子和表达情况。2、细胞培养:采用小鼠小胶质细胞(Mouse small glioma cells,BV-2)放置于37℃的含5%CO2细胞培养箱中。细胞于对数生长期至80%融合后,以DMEM高糖培养基配制一定氟离子浓度溶液,分别用浓度为0、1、5、10、50、100 ppm的F~-染毒同时选用不同浓度(100、500、1000 ng/mL)脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)做阳性对照。细胞活力用MTT的还原率表示。ELISA检测BV-2细胞IL-6分泌水平。RT-PCR和western blot方法检测相关炎性因子和MAPKs和NF-κB信号通路活化情况,及其对分泌的影响。神经元原代培养鉴定,western blot方法检测氟处理的BV-2细胞培养基对原代培养的神经元Caspase-3,BCL-2,BAX蛋白表达的影响。结果:1、动物实验:1.1各组大鼠的一般状况:第4周左右,氟暴露大鼠开始出现氟斑牙,氟暴露10周后大鼠氟斑牙症状明显。1.2氟在血清和脑组织分布情况:大鼠血清和脑的氟离子含量均显著增高(P<0.01);1.3亚慢性氟暴露对大鼠脑组织病理学的影响:光镜显示,染毒组大鼠脑皮质组织中,细胞核周围腔隙增宽,吞噬小体出现。透射电镜结果显示细胞核内的变化提示出现凋亡。1.4亚慢性氟暴露大鼠脑皮质和海马凋亡情况:TUNEL实验检测结果显示,氟处理组大鼠皮质和海马TUNEL阳性(红色荧光)细胞数量显著增加。1.5亚慢性氟暴露对脑凋亡相关因子蛋白表达的影响:120 ppm氟暴露组大鼠脑皮质BCL-2表达水平显著低于对照组(P<0.05),脑皮质各氟暴露组BAX表达水平无统计学差异。120 ppm氟暴露组海马BAX表达水平与对照组比较显著增强(P<0.05)。1.6亚慢性氟暴露诱导大鼠脑小胶质细胞活化:采用小胶质细胞特异性抗体OX-42标记大鼠皮质和海马的小胶质细胞,观察到60 ppm和120 ppm氟暴露组大鼠皮质和海马OX-42表达水平增强,高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。大鼠皮质和海马OX-42免疫荧光强度随染毒剂量增高而增加,呈现相关关系(r=0.735,P=0.007和r=0.934,P<0.001)。1.7亚慢性氟暴露大鼠脑皮质和海马小胶质细胞炎性因子表达情况:60 ppm氟暴露组皮质小胶质细胞IL-1β、IL-6表达水平显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。120 ppm氟暴露组大鼠脑皮质小胶质细胞IL-6表达水平显著高于60 ppm氟暴露组(P<0.05)和对照组(P<0.01)。120 ppm氟暴露组大鼠海马小胶质细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平增加,显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。120 ppm氟暴露组大鼠海马小胶质细胞IL-6表达高于60 ppm氟暴露组(P<0.05)。2、细胞实验:2.1氟对BV-2小胶质细胞活力的影响:细胞经0、0.1、0.5、1、5、10、50和100 ppm F~-处理24 h后,浓度低于10 ppm F-对细胞活力无显著影响,50和100 ppm染氟剂量使细胞活力显著下降(P<0.05),且染毒剂量越高活力越低,呈现相关关系(r=-0.792,P<0.001)。2.2氟对BV-2细胞内IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达的影响:0、1、5、10、25 ppm F~-处理BV-2细胞24h,各氟处理组IL-1βmRNA水平与对照组比较显著增加(P<0.05),25 ppm氟处理组IL-6mRNA水平与对照组比较显著增加(P<0.05),10、25 ppm氟处理组TNF-αm RNA水平与对照组比较显著增加(P<0.05)。2.3ELISA方法检测培养液IL-6水平,发现25 ppm氟处理组IL-6分泌水平显著升高(P<0.05)。2.4氟对BV-2细胞MAPK信号转导通路中ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、P38、p-P38蛋白表达的影响:25 ppm氟处理组JNK和p-JNK蛋白表达均高于对照组(P<0.05)和1 ppm氟处理组(P<0.05);25 ppm氟处理组P38,p-P38蛋白表达均高于对照组(P<0.05);ERK,p-ERK各剂量组之间表达没有明显差异。2.5氟对BV-2细胞NF-κB信号通路中IKKα蛋白表达的影响:5 ppm,10 ppm和25 ppm氟处理组IKKα蛋白表达均高于对照组(P<0.05),10 ppm和25 ppm氟处理组NF-κB蛋白表达均高于对照组(P<0.05)。2.6 MAPK和NF-κB信号传导通路在氟诱导小胶质细胞炎性因子表达中的作用:NF-κB抑制剂PDTC显著抑制氟诱导的TNF-α,IL-1β和IL-6 mRNA的表达(P<0.05),JNK/MAPK抑制剂SP600125显著抑制氟诱导的IL-1β和TNF-αmRNA表达水平(P<0.05)。并且NF-κB抑制剂较JNK抑制剂对IL-6抑制作用更显著(P<0.05),而JNK抑制剂较NF-κB抑制剂对TNF-α抑制作用更显著(P<0.05)。2.7 MAPK和NF-κB信号通路在氟诱导小胶质细胞IL-6分泌中的作用:与25 ppm氟处理组比较,NF-κB抑制剂PDTC和JNK抑制剂SP600125均能够降低氟诱导的BV-2培养液中IL-6分泌的增加(P<0.05)。2.8氟对BV-2小胶质细胞活化状态影响,1~25 ppm F~-处理组iba-1表达水平增强,免疫荧光密度均高于对照组。2.9神经元原代培养及氟处理的BV-2小胶质细胞培养基对原代培养的神经元Caspase-3,BCL-2,BAX蛋白表达的影响。Caspase-3和Bax的蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.01),BCL-2/Bax显著低于对照组(P<0.01)。结论:1、亚慢性氟暴露能够引起大鼠脑神经元损伤,抗凋亡因子BCL-2蛋白表达水平下降,促凋亡因子BAX表达蛋白水平增加,可能加速了脑神经元的凋亡。2、亚慢性氟暴露诱导大鼠脑皮质及海马小胶质细胞活化,增加促炎因子TNF-α,IL-1β和IL-6水平。3、氟能够激活BV-2小胶质细胞P38/MAPK,JNK/MAPK和NF-κB信号通路。4、氟能够增加BV-2小胶质细胞炎性因子IL-6、TNF-α和IL-1βmRNA表达水平和IL-6的分泌。5、JNK和NF-κB信号通路参与了氟诱导的BV-2小胶质细胞炎性因子TNF-α,IL-1β和IL-6mRNA的表达。