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流行性乙型脑炎(epidemic encephalitis B)又称日本乙型脑炎,简称乙脑,是由流行性乙型脑炎病毒引起的一种蚊媒性人兽共患传染病。本研究主要以乙型脑炎病毒E蛋白及其主要抗原表位蛋白为包被抗原,应用间接ELISA方法,分析鉴定乙脑病毒E蛋白上主要抗原表位的分布情况,本研究的主要内容如下：1.乙脑病毒E蛋白基因的克隆与表达本研究通过PCR方法以pMD19T-ME为模板扩增出乙脑病毒E蛋白基因(简称E基因),该基因大小为1500bp,并将其克隆到pMD19T载体上,通过酶切将E基因亚克隆到原核表达载体pET28a(+)上,经PCR和酶切鉴定,将鉴定正确的重组质粒转入大肠杆菌表达宿主BL21中,并在IPTG的诱导下表达E蛋白,经SDS-PAGE鉴定E蛋白约为55KDa,与预测的E蛋白大小基本一致。该实验结果表明本试验构建的原核表达重组载体pET28a(+)-E能在大肠杆菌表达宿主BL21中成功表达。乙脑病毒主要包膜蛋白E基因的成功克隆与表达为乙脑病毒E蛋白单克隆抗体的分析筛选奠定了研究基础。2.乙脑病毒E蛋白单克隆抗体的初筛本研究将E蛋白作为包被抗原,与乙脑病毒猪阳性血清反应确定E蛋白抗体检测ELISA方法的最佳包被浓度,当E蛋白的包被浓度达到200ug/ml时,判定ELISA结果的P/N值最大,且其阳性反应孔的OD450值最接近1,而阴性和对照孔的OD值小于0.2,试验确定ELISA检测的E蛋白包被浓度为200ug/ml。以建立的ELISA方法与对已制备的乙脑病毒单克隆抗体进行筛选检测能特异性识别E蛋白的乙脑病毒单克隆抗体。根据判定结果16份乙脑单克隆抗体中筛选有13份特异性识别E蛋白的单克隆抗体,其余3份乙脑单克隆抗体不能与E蛋白发生特异性识别。研究结果进一步揭示以乙脑病毒为抗原制备的单抗,应用E蛋白为抗原进行筛选成功率较高,也为进一步分析、鉴定E蛋白上抗原表位的分布情况奠定了研究基础。3.乙脑病毒E蛋白主要抗原表位蛋白基因的克隆表达本研究根据蛋白质构象分析预测软件将E蛋白分为包含其三个结构域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)的六段连续重叠的蛋白片段(即日本乙型脑炎病毒E蛋白的主要抗原表位片段)。本研究通过PCR方法以pMD19T-E为模板分别扩增六段连续重叠的E蛋白主要抗原表位基因并将其命名为e1(大小为186bp,编码62个氨基酸残基)；e2(大小为249bp,编码83个氨基酸残基);e3(大小为213bp,编码71个氨基酸残基)；e4(大小为345bp,编码115个氨基酸残基);e5(大小为336bp,编码112个氨基酸残基)；e6(大小为327bp,编码109个氨基酸残基),然后将该六段基因分别克隆到pMD19T载体上,再通过PCR和酶切的方法将这六段基因分别亚克隆到原核表达载体PRSET(a)上,将鉴定者正确的阳性重组质粒分别转入大肠杆菌表达宿主BL21中然后在IPTG的诱导下进行表达,收集表达产物进行SDS-PAGE电泳,经分析构建的六种原核表达载体都能正确表达与预期大小基本相符的抗原表位蛋白。本试验结果为进一步分析鉴定E蛋白上抗原表位的分布情况奠定了材料基础。4.乙脑病毒E蛋白单克隆抗体的主要抗原表位鉴定本研究分别将六段抗原表位蛋白作为包被抗原,与乙脑病毒猪阳性血清反应确定该六段抗原表位蛋白抗体检测ELISA方法的最佳包被浓度。以建立的ELISA方法对13份乙脑病毒E蛋白单克隆抗体进行筛选检测能特异性识别E蛋白主要抗原表位的单克隆抗体,从而初步鉴定E蛋白上主要抗原表位的分布情况。研究结果表明13份E蛋白单克隆抗体可识别其不同的抗原表位蛋白。其中,单克隆抗体7B5、10G3、15B5可特异性识别抗原表位蛋白基因e5；单克隆抗体9C5、12F3可特异性识别抗原表位蛋白基因e6,而该两段抗原表位蛋白基因位于包含乙脑病毒中和抗原表位的E蛋白结构Ⅲ中,所以,该5株单克隆抗体中可能存在能特异性识别乙脑病毒中和抗原表位的单克隆抗体。本试验研究结果为后续乙脑病毒中和单克隆抗体的筛选鉴定以及乙脑疾病的被动治疗提供了相关新思路。